Composiciones de trombina.

Una composición liofilizada preparada a partir de una solución que consiste esencialmente en trombinarecombinante humana,

sacarosa, manitol, NaCl, CaCl2, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y untampón fisiológicamente aceptable,

en la que la concentración de dicha trombina recombinante humana en dicha solución es de 0,1 5 mg/ml a 5,0 mg/ml;

la concentración de dicha sacarosa en dicha solución es del 2% al 4% (p/v);

la concentración de dicho manitol en dicha solución es del 3,5% al 5% (p/v);

la concentración de dicho NaCl en dicha solución es de 50 mM a 300 mM;

la concentración de dicho CaCl2 en dicha solución es de 0 mM a 5 mM; y

la concentración de dicho tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular en dicha solución es del 0,03% al 1%(p/v),

en la que dicha solución tiene un pH de 5,7 a 7,4 y proporciona un pH aproximadamente fisiológico tras la aplicaciónde la composición en un entorno quirúrgico, y en la que dicha solución tiene una relación de manitol:sacarosa que esmayor de 1:1 pero no mayor de 2,5:1 (p/p).

Composiciones de trombina Antecedentes de la invención La formulación de las proteínas farmacéuticas presenta desafíos significativos. Las proteínas poseen múltiples grupos funcionales además de una estructura tridimensional; por tanto, la degradación se produce tanto por la vía química (modificaciones que implican la formación de enlaces o escisión) como por la vía física (desnaturalización, agregación, adsorción, precipitación) . Como cada proteína expresa una única combinación de aminoácidos, secuencia, punto isoeléctrico y otros determinantes, su respuesta a los cambios en condiciones de solución es impredecible y debe determinarse caso por caso. Las tentativas de prevenir una forma de degradación a menudo aumentan la tasa de otra.

La degradación de las proteínas puede evitarse o reducirse mucho por liofilización. Sin embargo, la liofilización requiere tiempo y es costosa, y puede causar la desnaturalización y la agregación de las proteínas si no se incluyen los excipientes adecuados. Como ocurre en la formulación en solución, la estabilización de las proteínas liofilizadas tiene que llevarse a cabo individualmente.

En el caso de la trombina, se puede usar cloruro sódico para mantener la estabilidad durante la purificación y el almacenamiento ya que reduce la agregación y la precipitación. Sin embargo, el cloruro sódico es un excipiente problemático en las formulaciones liofilizadas porque baja la temperatura de transición vítrea, con lo que se necesitan temperaturas primarias bajas y ciclos largos. Además, la trombina tiene que protegerse del desplegamiento y la agregación en la composición liofilizada.

La formulación ideal combinará la estabilidad durante la liofilización, así como el almacenamiento a largo plazo y el transporte con la facilidad de manejo y de uso.

El documento US-A-4923815 describe una composición estable de trombina desecada, que comprende sacáridos. Entre los sacáridos de interés se mencionan la sacarosa y el manitol.

Descripción de la invención Dentro de un aspecto de la invención se proporciona una composición que esencialmente consiste en 0, 1 mg/ml a 5, 0 mg/ml de trombina, de un 2% a un 4% (p/v) de sacarosa, de un 3, 5% a un 5% (p/v) de manitol, NaCl de 50 mM a 300 mM, CaCl2 0-5 mM, de un 0, 03% a un 1% (p/v) de un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y un tampón aceptable fisiológicamente, en una solución acuosa con un pH de 5, 7-7, 4, en la que la concentración del tampón se selecciona para proporcionar un pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un entorno quirúrgico y en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor de 1:1 pero no mayor de 2, 5:1 (p/p) . Dentro de una realización de la invención, la relación entre manitol y sacarosa es 1, 33:1 (p/p) . Dentro de otras realizaciones de la invención, la relación molar de sacarosa:trombina es al menos de 700:1 o al menos 2000:1. Dentro de realizaciones adicionales de la invención, la trombina es trombina humana, incluyendo, por ejemplo, trombina recombinante humana. Dentro de otras realizaciones de la invención, la concentración de trombina es de 0, 5-3, 0 mg/ml o la concentración de trombina es de 1 mg/ml. Dentro de otras realizaciones de la invención, la concentración de sacarosa es del 3% (p/v) y/o la concentración de manitol es del 4% (p/v) . Dentro de una realización adicional, el tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es PEG 3350. Dentro de una realización relacionada, el tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular es PEG 3350 a una concentración del 0, 1% (p/v) . Dentro de realizaciones adicionales, el pH de la composición es 6, 0. Dentro de realizaciones adicionales, el tampón se selecciona del grupo que consiste en tampones de histidina, citrato, fosfato, Tris y succinato. Dentro de realizaciones relacionadas, el tampón es tampón de histidina, tal como el tampón de histidina 2, 0-10 mM o el tampón de histidina 5 mM. Una de dichas composiciones de la presente invención consiste esencialmente en 0, 1 mg/ml a 5, 0 mg/ml de trombina, de un 2% a un 4% (p/v) de sacarosa, de un 3, 5% a un 5% (p/v) de manitol, NaCl de 100 mM a 200 mM, CaCl2 de 1 mM a 5 mM, de un 0, 03% a un 1% (p/v) de PEG3350 e histidina de 2 mM a 10 mM en solución acuosa a pH 5, 5 - 6, 5, en la que la relación de manitol:sacarosa es mayor de 1:1 pero no mayor de 2, 5:1 (p/p) . Otra de dichas composiciones de la invención consiste esencialmente en 1 mg/ml de trombina, un 3% (p/v) de sacarosa, un 4% (p/v) de manitol, CaCl2 4 mM, un 0, 1% (p/v) de PEG3350, NaCl 150 mM e histidina 5 mM en solución acuosa a pH 6, 0.

Dentro de un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición de trombina liofilizada que comprende (a) proporcionar una composición acuosa que contiene trombina como se desveló anteriormente y (b) liofilizar la composición acuosa para formar una composición de trombina liofilizada.

Dentro de un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición de trombina liofilizada preparada por el procedimiento desvelado anteriormente. Dentro de una realización de la invención, la composición liofilizada está contenida en un recipiente sellado que tiene una etiqueta pegada a la superficie exterior del mismo. Dentro de una realización adicional de la invención, la composición en el recipiente sellado contiene de 2.500 a 20.000 unidades NIH de trombina. Dentro de una realización relacionada de la invención, la composición se proporciona en forma de un kit que comprende un recipiente sellado como se desveló anteriormente y un segundo recipiente sellado que contiene un diluyente tal como, por ejemplo, una solución salina normal.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes al consultar la siguiente descripción detallada de la invención y los dibujos adjuntos. En los dibujos:

La Fig.1 ilustra el análisis de muestras extraídas antes y después de la liofilización de ciertas formulaciones de trombina por Dispersión de Luz en Ángulo Recto (RALS) La Fig. 2 Ilustra el análisis de ciertas formulaciones de trombina por RALS tras el almacenamiento durante trece semanas. La Fig. 3 Ilustra el análisis de ciertas formulaciones de trombina por RALS tras el almacenamiento durante seis meses. La Fig. 4 Ilustra el análisis de la estructura secundaria de la trombina por espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier usando cuatro formulaciones de trombina recombinante humana (etiquetadas como A, B, C y D) . La Fig. 5 Ilustra el análisis de la estructura secundaria de la trombina por espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier usando cinco formulaciones de trombina recombinante humana (etiquetadas como T, A, B, C, y D) .

Los intervalos numéricos (por ejemplo, “desde X a Y”) incluyen los puntos finales a no ser que se especifique otra cosa.

La presente invención proporciona composiciones estabilizadas de trombina, incluyendo composiciones liofilizadas. Tal como se usa en el presente documento, “trombina” significa la enzima activada, también conocida como αtrombina, que se obtiene como resultado de la escisión proteolítica de la protrombina (factor II) . Como se desvela posteriormente, la trombina se puede preparar por diversos procedimientos conocidos en la técnica, y el término “trombina” no pretende implicar un procedimiento de producción en particular. La trombina humana es una proteína de 295 aminoácidos compuesta por dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. En la presente invención pueden usarse tanto trombinas humanas como no humanas. La trombina se utiliza en medicina como un agente hemostático y como un componente de los adhesivos de tejidos.

Las trombinas tanto humana como no humana (por ejemplo, bovina) se preparan de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. La purificación de la trombina a partir del plasma se desvela, por ejemplo, por Bui-Khac y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.981.254. La purificación de la trombina a partir de fracciones del plasma, tal como la fracción III de Cohn, se desvela por Fenton y col., J. Biol. Chem. 252: 3587-3598, 1977. La trombina recombinante puede prepararse a partir de un precursor de pretrombina por activación con un activador de veneno de serpiente como se desveló en la Patente de Estados Unidos Nº 5.476.777. Los activadores de veneno adecuados incluyen la ecarina y el activador de protrombina de Oxyuranus scutellatus.

Dentro de la presente invención, la trombina se formula en una solución acuosa débilmente tamponada que contiene sacarosa, manitol, cloruro sódico, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular (HMW-PEG) y, opcionalmente,... [Seguir leyendo]

1. Una composición liofilizada preparada a partir de una solución que consiste esencialmente en trombina recombinante humana, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl2, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y un tampón fisiológicamente aceptable, en la que la concentración de dicha trombina recombinante humana en dicha solución es de 0, 1 mg/ml a 5, 0 mg/ml; la concentración de dicha sacarosa en dicha solución es del 2% al 4% (p/v) ; la concentración de dicho manitol en dicha solución es del 3, 5% al 5% (p/v) ; la concentración de dicho NaCl en dicha solución es de 50 mM a 300 mM; la concentración de dicho CaCl2 en dicha solución es de 0 mM a 5 mM; y la concentración de dicho tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular en dicha solución es del 0, 03% al 1% (p/v) , en la que dicha solución tiene un pH de 5, 7 a 7, 4 y proporciona un pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un entorno quirúrgico, y en la que dicha solución tiene una relación de manitol:sacarosa que es mayor de 1:1 pero no mayor de 2, 5:1 (p/p) .

2. Una composición liofilizada preparada a partir de una solución que consiste esencialmente en trombina recombinante humana, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl2, PEG 3350 y un tampón de histidina, en la que la concentración de dicha trombina recombinante humana en dicha solución es de 0, 1 mg/ml a 5, 0 mg/ml; la concentración de dicha sacarosa en dicha solución es del 2% al 4% (p/v) ; la concentración de dicho manitol en dicha solución es del 3, 5% al 5% (p/v) ; la concentración de dicho NaCl en dicha solución es de 100 mM a 200 mM; la concentración de dicho CaCl2 en dicha solución es de 1 mM a 5 mM; la concentración de dicho PEG 3350 en dicha solución es del 0, 03% al 1% (p/v) ; y la concentración de dicha histidina en dicha solución es de 2 mM a 10 mM; en la que dicha solución tiene un pH de 5, 5 a 6, 5 y proporciona un pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un entorno quirúrgico, y en la que dicha solución tiene una relación de manitol:sacarosa que es mayor de 1:1 pero no mayor de 2, 5:1 (p/p) .

3. Una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 2 preparada a partir de una solución a un pH de 6, 0 que comprende 1 mg/ml de trombina recombinante humana en histidina 5 mM, un 2% de sacarosa, un 5% de manitol, NaCl 150 mM, CaCl2 4 mM y un 0, 1% de PEG 3350.

4. Una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 2 preparada a partir de una solución a un pH de 6, 0 que comprende 1 mg/ml de trombina recombinante humana en histidina 5 mM, un 3% de sacarosa, un 5% de manitol, NaCl 150 mM, CaCl2 4 mM y un 0, 1% de PEG 3350.

5. Una composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 2 preparada a partir de una solución a un pH de 6, 0 que comprende 1 mg/ml de trombina recombinante humana en histidina 5 mM, un 3% de sacarosa, un 4% de manitol, NaCl 150 mM, CaCl2 4 mM y un 0, 1% de PEG 3350.

6. La composición liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en la que dicha relación entre manitol y sacarosa es 1, 33:1 (p/p) .

7. La composición liofilizada de cualquier reivindicación precedente en la que dicha solución tiene una relación molar de sacarosa:trombina que es al menos de 700:1.

8. La composición liofilizada de cualquier reivindicación precedente en la que dicha solución tiene una relación molar de sacarosa:trombina que es al menos de 2000:1.

9. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de trombina recombinante humana que es de 0, 5 a 3, 0 mg/ml.

10. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de trombina recombinante humana que es de 1 mg/ml.

11. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de sacarosa que es del 3% (p/v) .

12. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de manitol que es del 4% (p/v) .

13. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de sacarosa que es del 3% (p/v) y una concentración de manitol que es del 4% (p/v) .

14. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha solución tiene una concentración de PEG 3350 que es del 0, 1% (p/v) .

15. La composición liofilizada de la reivindicación 1 o 2, en la que el pH de dicha solución es 6, 0.

16. La composición liofilizada de la reivindicación 1, en la que dicho tampón fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en tampones de histidina, citrato, fosfato, Tris y succinato.

17. La composición liofilizada de la reivindicación 1, en la que dicho tampón fisiológicamente aceptable es un tampón de histidina.

18. La composición liofilizada de la reivindicación 17, en la que dicha concentración de tampón de histidina en dicha solución es de 2, 0 a 10 mM.

19. La composición liofilizada de la reivindicación 1, en la que dicho tampón fisiológicamente aceptable en dicha solución es histidina 5 mM a un pH de 6, 0.

20. Un kit que comprende un recipiente sellado que contiene dicha composición liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

21. Un kit de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el recipiente sellado contiene de 2500 unidades NIH a 20000 unidades NIH de trombina recombinante humana.

22. El kit de la reivindicación 20 o 21 que además comprende un segundo recipiente sellado que contiene un diluyente.

23. El kit de la reivindicación 22, en el que dicho diluyente es solución salina normal.

24. El uso de una composición en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tejido sangrante, en el que dicha composición se prepara en una solución acuosa que consiste esencialmente en: trombina, sacarosa, manitol, NaCl, CaCl2, un tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular, y un tampón fisiológicamente aceptable, en la que la concentración de dicha trombina en dicha solución es de 0, 1 mg/ml a 5, 0 mg/ml; la concentración de dicha sacarosa en dicha solución es del 2% al 4% (p/v) ; la concentración de dicho manitol en dicha solución es del 3, 5% al 5% (p/v) ; la concentración de dicho NaCl en dicha solución es de 50 mM a 300 mM; la concentración de dicho CaCl2 en dicha solución es de 0 mM a 5 mM; y la concentración de dicho tensioactivo o polietilenglicol de alto peso molecular en dicha solución es del 0, 03% al 1% (p/v) , en la que dicha solución tiene un pH de 5, 7 a 7, 4 y proporciona un pH aproximadamente fisiológico tras la aplicación de la composición en un entorno quirúrgico, y en la que dicha solución tiene una relación de manitol:sacarosa que es mayor de 1:1 pero no mayor de 2, 5:1 (p/p) : y en la que la preparación del medicamento incluye las etapas de liofilizar la solución acuosa para formar una composición de trombina liofilizada y reconstituir la composición de trombina liofilizada con un diluyente adecuado.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el medicamento comprende un adhesivo de tejidos o pegamento de fibrina.

26. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el tratamiento de un tejido sangrante comprende el uso de una esponja de gelatina absorbible.

27. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la composición reconstituida de trombina comprende trombina a 100 U NIH/ml a 5000 U NIH/ml.

28. La composición liofilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 – 19 para su uso en un procedimiento para conseguir la hemostasia, en la que el procedimiento incluye la reconstitución de la composición con un diluyente adecuado y su aplicación en un tejido sangrante.

29. Una composición de acuerdo con la reivindicación 28, en la que la aplicación en el tejido sangrante es en combinación con una esponja de gelatina absorbible.

30. Una composición de acuerdo con la reivindicación 28, en la que la composición es un componente de un adhesivo de tejidos o un pegamento de fibrina.

31. Una composición de acuerdo con la reivindicación 28, en la que la composición de trombina reconstituida comprende trombina de 100 U NIH/ml a 5000 U NIH/ml.