Una población sustancialmente purificada de células derivadas del amnios que se realiza mediante elprocedimiento de:

(a) disociar usando una proteasa como reactivo de disociación de las células derivadas del amnios de unamnios aislado de una placenta;

(b) recolectar las células derivadas del amnios disociadas; y

(c) cultivar las células derivadas del amnios recogidas en medio de cultivo que no contienen materialesderivados de animales distintos a la seroalbúmina humana

Composiciones celulares derivadas del amnios, procedimientos de fabricación y usos de las mismas

Campo de la invención

El campo de la invención está dirigido a poblaciones celulares derivadas del amnios, a composiciones que comprenden las poblaciones celulares derivadas del amnios, a poblaciones celulares expandidas derivadas del amnios, a procedimientos de crear dichas poblaciones celulares derivadas del amnios, así como a procedimientos de uso. En el presente documento también se describen anticuerpos, en concreto anticuerpos monoclonales, que se unen a las células derivadas del amnios o, como alternativa, a uno o más marcadores proteicos de superficie celular derivados del amnios, a procedimientos para producir los anticuerpos, a procedimientos para usar los anticuerpos y a kits que comprenden los anticuerpos.

Descripción de la técnica relacionada

Pruebas preliminares sugieren que las células epiteliales del amnios aisladas e introducidas en cultivo exhiben muchas de las características necesarias para definir una población de células madre (Brivanlou, A.H., y col., Science, 2003. 300 (5621) : Pág. 913-6) .

Se ha demostrado que las células madre derivadas de la placenta aisladas de placenta exhiben una expresión proteica heterogénea de los antígenos embrionarios específicos de etapa, SSEA-3 y SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, c-kit, y Thy-1 (véanse los documentos US2003/0235563 y US2004/0161419) . También se ha demostrado que estas células expresan las proteínas de superficie celular Oct4 y nanog, marcadores expresados por las células madre pluripotenciales. En las condiciones adecuadas, se ha demostrado que las células madre derivadas de placenta se diferencian en células con características de células hepáticas (hepatocitos) , células pancreáticas (es decir, células alfa y beta) , células del sistema nervioso central (neuronas y glía) , células de músculo cardíaco (cardiomiocitos) y células endoteliales vasculares. Las células madre derivadas de placenta son no tumorigénicas tras transplante (Miki, T., y coI., Stem Cells 2005; 23:1549-1559) . De hecho, no se han observado tumores en ratones inmunocomprometidos tras transplante de más de 2 millones de células madre derivadas de placenta, condiciones bajo las cuales las células ES forman tumores no malignos conocidos como teratomas. Los documentos US2003/0235563 y US2004/0161419 divulgan estudios preliminares que indican que las células madre derivadas de placenta cultivadas en Matrigel suplementado con nicotinamida 10 mM durante 14 días expresan insulina y glucagón, así como los marcadores de células pancreáticas PDX1 (faint) , Pax6 and Nkx2.2.

Otros han transplantado células amnióticas en voluntarios y pacientes, en un intento de corregir las enfermedades de almacenamiento en lisosomas son pruebas de tumorigenicidad (Tylki-Szymanska, A., y col., Journal of Inherited Metabolic Disease, 1985. 8 (3) : p. 101-4; Yeager, A.M., y col., . American Journal of Medical Genetics, 1985.22 (2) : Pág. 347-55) .

La membrana amniótica se transplanta con regularidad como injerto para la reconstrucción de superficie ocular sin la posterior formación de tumor (John, T., Human amniotic membrane transplantation: past, present, and future. Opthalmol Clin North Am, 2003. Mar 16 (1) : Pág. 43-65 vi) . Esta falta de tumorigenicidad es una distinción importante entre las células ES y las células madre derivadas de placenta.

Los resultados de estudios preliminares con otras células se divulgan en los documentos WO 2005/017117, W02005/0042595, US 2005/0019865, US2005/0032209, US2005/0037491 , US2005/0058631 , and US2005/0054093. Los resultados de estudios preliminares con estas otras células indican que tienen el potencial de diferenciarse en varios tipos celulares.

Las membranas amnióticas se han usado clínicamente como vendajes de heridas para pacientes quemados durante más de 100 años para estimular la epitelización, reducir el dolor y prevenir la infección (Bose, B. (1979) Ann R Coil Surg Engl, 61 :444-7; Sawhney,

C. P. (1989) Burns, 15:339-42, Thomson, P. D., Parks, D. H. (1981) Ann Past Surg, 7:354-6) . En el documento US2003/0235580 se describe un procedimiento de liberar moléculas terapéuticas en la piel usando células epiteliales amnióticas. En el documento US2004/0057938 se describe el uso de una composición de membrana amniótica humana para profilaxis y tratamiento de enfermedades y afecciones de los ojos y la piel. La patente de EE.UU. Nº 4, 361, 552 describe un procedimiento de tratar una herida o quemadura, que comprende cubrir la superficie de la herida o quemadura con un vendaje amniótico reticulado.

En el documento US2004/0170615 se describe el uso de compuestos expresados en tejido fetal para usar en la reparación de la piel y la mejora del aspecto de la piel.

Wei, y col. (Wei, JP, y col., (2003) Cell Transplantation 12:545-552) han demostrado que las células aisladas de amnios humano pueden normalizar la glucemia en ratones diabéticos inducidos con estreptozocina.

Antecedentes de la invención

Células madre- Las células madre tienen el extraordinario potencial de desarrollarse en muchos tipos celulares diferentes en el organismo. Al servir como sistema de reparación del cuerpo, teóricamente se pueden dividir sin límite para reponer otras células a lo largo de la vida de una persona. Cuando una célula madre se divide, cada nueva célula tiene el potencial de seguir siendo una célula madre o de convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada, tal como una célula muscular, un glóbulo rojo o una célula cerebral. Quizá la potencial aplicación más importante de las células madre humanas es la generación de células y tejidos que se puedan usar para terapias celulares. Se proporcionan ejemplos de estudios con células madre en Tylki-Szymanska, A., y col., Journal of Inherited Metabolic Disease, 1985.8 (3) : pág. 101-4; Yeager, A.M., y col., American Journal of Medical Genetics, 1985.22 (2) : pág. 347-55; John, 1., 2003. 16 (1) : pág. 43-65 vi) .

El tejido de placenta es muy abundante como fuente desechada de un tipo de célula madre denominada células madre derivadas de placenta. Aunque se desechan como parte de las membranas placentarias, el análisis del linaje muestra que, al contrario que otros tejidos de la placenta, la capa epitelial del amnios, de la que se aíslan las células madre derivadas de placenta, solo desciende del epiblasto en el desarrollo embrionario (Figura 1) . El epiblasto contiene las células que, en última instancia, se diferenciarán en el embrión y las células que darán lugar a un tejido embrionario adicional, el amnios. Hasta ahora solo se han descrito cuatro tipos celulares descritos en la literatura son pluripotenciales. Estas son la masa celular interna (MCI) del embrión pre-implantación, que da lugar el epiblasto, el propio epiblasto, las células madre embrionarias (ES) y germinales embrionarias (EG) . Por tanto, la identificación, purificación y propagación de una población celular pluripotencial a partir de tejido amniótico desechado proporcionarían una fuente extremadamente valiosa de células madre para terapia de sustitución celular.

Con un rendimiento medio de más de 200 millones de células madre derivadas de placenta por placenta, de esta fuente se puede obtener un gran número de células. Si las células madre derivadas de placenta fueran a convertirse en células útiles para la medicina de transplantes, podrían proporcionar un suministro casi inagotable de material de partida en cualquier parte del mundo. Ninguna otra fuente de células madre proporciona una población de células de partida tan grande y la recolección no requiere un procedimiento invasivo ni destructivo. Además, no existen problemas éticos, religiosos ni sociales asociados con estas de células madre derivadas de placenta, ya que el tejido deriva de la placenta.

Otra consideración importante en las terapias con células madre es la tolerancia al injerto. En seres humanos, inicialmente se pensó que la expresión proteica del marcador de superficie celular HLA-G estaba restringida a sitios privilegiados inmunitarios, como la placenta, así como a células relacionadas, incluidas algunas aisladas del líquido amniótico, macrófagos placentarios y sangre de cordón umbilical, lo que implica su papel en la tolerancia maternofetal (Urosevic, M. y Dummer, R. (2002) ASHI Quarterly; 3rd Quarter 2002:106-109) . Adicionalmente, en estudios sobre aceptación de injertos cardiacos se ha sugerido que... [Seguir leyendo]

1. Una población sustancialmente purificada de células derivadas del amnios que se realiza mediante el procedimiento de:

(a) disociar usando una proteasa como reactivo de disociación de las células derivadas del amnios de un amnios aislado de una placenta;

(b) recolectar las células derivadas del amnios disociadas; y

(c) cultivar las células derivadas del amnios recogidas en medio de cultivo que no contienen materiales derivados de animales distintos a la seroalbúmina humana

2. La población sustancialmente purificada de la reivindicación 1, en la que las células derivadas del amnios recogidas son negativas para la expresión de marcadores proteicos G090 y G0117.

3. La población sustancialmente purificada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que las células no están xeno-contaminadas.

4. La población sustancialmente purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es una composición expandida de células derivadas del amnios.

5. La composición de la reivindicación 4 que carece de animales.

6. La composición de la reivindicación 4, en la que las células derivada del amnios forman esferoides.

7. La composición de la reivindicación 4, que tiene una concentración de al menos 500 x 106 células derivadas del amnios/g del amnios de partida.

8. Una composición que comprende medio acondicionado obtenido de la población o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una composición farmacéutica, que comprende la población o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición de la reivindicación 9 para usar en terapia

11. El uso de la composición de la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la cicatrización de heridas o la pérdida de audición en un sujeto que sufre una afección que se beneficiaría del mismo

12. La composición de la reivindicación 10, para usar en un procedimiento para el tratamiento de la cicatrización de heridas o la pérdida de audición.

13. El uso de la composición de la reivindicación 11 o la composición para usar de la reivindicación 12, en el que la herida se selecciona del grupo constituido por heridas mecánicas, térmicas, agudas, crónicas, infectadas y estériles.

14. Una preparación cosmética que comprende una población o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. Un procedimiento de obtener una población sustancialmente purificada de células derivadas del amnios que comprende las etapas de

(a) disociar usando una proteasa como reactivo de disociación de las células derivadas del amnios de un amnios aislado de una placenta;

(b) recolectar las células derivadas del amnios disociadas; y

(c) cultivar las células derivadas del amnios recogidas en medio de cultivo que no contienen materiales derivados de animales distintos a la seroalbúmina humana

16. La población sustancialmente purificada de la reivindicación 1, que además es negativa para la expresión de telomerasa.