Una composición inmunogénica en un volumen apropiado para una dosis humana que comprende un antígeno opreparación antigénica,

en combinación con un coadyuvante que comprende una fracción de saponinainmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposomay un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dichadosis humana a un nivel de entre 1 Ig y 30 Ig.

Composición inmunogénica que comprende un adyuvante Campo técnico La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para hacerlas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas con adyuvante en lasque el adyuvante es una formulación liposomal, que comprende una saponina y un lipopolisacárido. La presenteinvención se refiere además a formulaciones de vacuna de la gripe y regímenes de vacunación para inmunizaciónfrente a la enfermedad de la gripe.

Antecedentes técnicos

Se necesitan siempre composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.

Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de la bacteria por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño y consisten en tres regiones unidas de forma covalente:

(i) una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa

(ii) una región central de oligosacárido del núcleo

(iii) lípido A - la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido deglucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.

Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y adyuvancia, estánrelacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente depolisacárido O-específico (antígeno O) . Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por susefectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones devacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido Amanteniendo al mismo tiempo su adyuvancia.

El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitz y col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374) . En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisiscon un grupo de fagos, y sólo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno

o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.

En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.

(i) no contienen región O-específica - una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia

(ii) la región del núcleo es muy corta - esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos

(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.

El 4'-monofosforil lípido A (MPL) , que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando unatoxicidad que está reducida en un factor de más de 100 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios depollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516) . Los LPS se calientan a relujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0, 1 M) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y descarbohidrataciónen la posición 6', produciendo MPL.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) , que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la adyuvancia, véase el documento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals) . La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla decloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0, 5 M a pH 10, 5.

Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation) .

Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria. Se han empleado de forma extensa saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxicapurificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de EstadosUnidos Nº 5.057.540.

A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.

Los virus de la gripe son uno de los virus más ubicuos presentes en el mundo, afectando tanto a seres humanoscomo al ganado. La gripe produce una carga económica, morbilidad e incluso mortalidad, que son significativos.

El virus de la gripe es un virus de ARN con cubierta con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de diámetro. Consiste básicamente en una nucleocápside interna o núcleo de ácido ribonucleico (ARN) asociado connucleoproteína, rodeado por una envuelta vírica con una estructura de bicapa lipídica y glicoproteínas externas. Lacapa interna de la envuelta vírica está compuesta predominantemente por proteínas de la matriz y la capa externa en su mayor parte por material lipídico derivado del huésped. El virus de la gripe comprende dos antígenos desuperficie, las glicoproteínas neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) , que aparecen como puntas, de 10 a 12 nmde longitud, en la superficie de las partículas. Son estas proteínas de superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigénica de los subtipos de gripe.

Estos antígenos de superficie, de manera progresiva, a veces rápidamente, experimentan algunos cambios que conducen a las variaciones antigénicas de la gripe. Estos cambios antigénicos, llamados "derivas" y "cambios", son impredecibles y pueden tener un impacto drástico desde un punto de vista inmunológico ya que con el tiempoconducen a la aparición de nuevas cepas de la gripe que permiten al virus escapar del sistema inmune causando las epidemias bien conocidas, casi anuales.

Las cepas del virus de la gripe a incorporar en la vacuna de la gripe cada temporada las determina la OrganizaciónMundial de la Salud en colaboración con las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas.

La HA es el antígeno más importante para definir la especificidad serológica de las diferentes cepas de la gripe. Estaproteína de 75-80 kD contiene numerosos determinantes antigénicos, varios de los cuales están en regiones queexperimentan cambios en la secuencia en diferentes cepas (determinantes específicos de la cepa) y otros en regiones que son comunes a muchas moléculas de HA (comunes a determinantes) .

Los virus de la gripe causan epidemias casi cada invierno, con tasas de infección para el virus de tipo A o B tan altascomo del 40% durante un periodo de seis semanas. La infección de la gripe produce diversas patologías, desde una infección subclínica por infección leve de las vías respiratorias superiores hasta una neumonía vírica grave. Lasepidemias de gripe típicas causan aumentos en la incidencia de neumonía y enfermedades de las vías respiratoriasinferiores como atestiguan las tasas aumentadas de hospitalización o mortalidad. La gravedad de la enfermedad sedetermina principalmente por la edad del huésped, su estado inmune y el sitio de infección.

Las personas ancianas, de 65 años de edad o por encima, son especialmente vulnerables, representando el 80-90%de todas las muertes relacionadas con la gripe en países desarrollados. Es más probable también que los individuoscon enfermedades crónicas subyacentes experimenten tales complicaciones. Los lactantes jóvenes pueden sufrirtambién enfermedad grave. Por lo tanto se necesita proteger a estos grupos... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica en un volumen apropiado para una dosis humana que comprende un antígeno opreparación antigénica, en combinación con un coadyuvante que comprende una fracción de saponinainmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposomay un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dichadosis humana a un nivel de entre 1 Ig y 30 Ig.

2. Una composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que dicha composición coadyuvante comprendeadicionalmente un esterol, en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.

3. Una composición antigénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha fracción de saponinainmunológicamente activa es QS21.

4. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en la que dicho esterol escolesterol.

5. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido es underivado de lípido A.

6. Una composición inmunogénica según la reivindicación 5, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

7. Una composición inmunogénica según la reivindicación 6, en la que la relación QS21.

3. MPL es 1 : 1.

8. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido está presente en una cantidad de 25 Ig.

9. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido está presente en una cantidad de 1-15 Ig.

10. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicha saponina está presente en una cantidad de 1 - 25 Ig.

11. Una composición inmunogénica según la reivindicación 10, en la que dicha saponina está presente en unacantidad de 25 Ig.

12. Una composición inmunogénica según la reivindicación 10, en la que dicha saponina está presente en unacantidad de 1 - 10 Ig.

13. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho volumen de dosishumana adecuado para uso humanoestá entre 0, 5 y 1, 5 ml.

14. Una composición inmunogénica según la reivindicación 7, en la que QS21 y ED-MPL están a un nivel de entre20-30 !g.

15. Una composición adyuvante en un volumen adecuado para usar en una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende entre 1 y 30 !g de un lipopolisacárico y entre 1 y 30 !g de una fracción de saponina inmunológicamente activa presentada en forma de un liposoma.

16. Una composición adyuvante según la reivindicación 15, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípidi A.

17. Una composición adyuvante según la reivindicación 16, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

18. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.

19. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho volumen adecuadopara dosis humana es 250 Il.

20. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho volumen adecuadopara dosis humana es 360 Il.

21. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 25 Ig.

22. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 10 Ig.

23. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 5 Ig.

24. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 25 Ig.

25. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 10 Ig.

26. Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 5 Ig.

27. Una dosis humana de una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para uso enmedicina.

Figura 1 -

MPL® en polvo L Suspensión (10 mg/ml) L Tratamiento térmico L Enfriamiento L Microfluidización L Dilución a 2 mg/ml L Prefiltración en 0, 65 Im L Filtración en 0, 2 Im L Dilución a 1 mg/ml L Almacenamiento a +2/+8º C

Figura 2 -

Figura 3 - Figura 4 - Figura 5 - Figur.

6.

Figura 7

Figura 8

% de síntomas reseñados (con IC 95%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD

Rel. de grado 3 AS01B

Rel. de grado 3 AS01E

Rel. de grado 3

Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E

Rel. de grado 3

Grupo de vacuna Figura 9: Figura 10: Figura 11: Figura 12: Figura 13: Figura 14:

Figura 16:

% específico de CMV en la población de CD8+

1, 5

1, 0

0, 5

0, 0

1, 5μg gB simple CD8+IL2+INFg+ 0, 00 CD8+IL2+ 0, 00 CD8+INFg+ 0, 02

Reestimulación con péptidos de gB 2 μg/ml

2, 0

1, 5μg gB AS01b 0, 00 0, 00 0, 04

1, 5μg gB NaclAS01e

0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 02 0, 00

Figura 18: Figura 19: Figura 20:

Figura 21:

AS01B AS01E

RTS, S 10μg -AS01B RTS, S 5μg -AS01B RTS, S 2, 5μg -AS01B RTS, S 10μg -AS01E RTS, S 5μg -AS01E RTS, S 2, 5μg -AS01E

Figura 22: Figura 23: Figura 24: Figura 25: