Una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína,

comprendiendo la composición dedesbridamiento enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, estando dichacomposición sustancialmente desprovista de inhibidores de la bromelaína.

Composición de desbridamiento a partir de bromelaína y procedimientos de producción de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína y a los procedimientos para producir la misma. Particularmente, la presente invención se refiere a una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína que comprende enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, estando esencialmente desprovista de inhibidores de bromelaína, y a composiciones farmacéuticas que comprenden la misma. Las composiciones de desbridamiento y las composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas son particularmente útiles en el desbridamiento de tejidos con escaras y en la cicatrización de heridas.

Antecedentes de la invención

Se ha realizado un considerable esfuerzo para desarrollar preparaciones de desbridamiento que sean capaces de eliminar el tejido desvitalizado sin cirugía. El tejido desvitalizado se forma en todos los procesos patológicos que están asociados con un traumatismo epitelial, tales como úlceras de decúbito, necrosis por presión, incisiones y quemaduras. Un desbridamiento eficaz es esencial dado que el tejido desvitalizado es un excelente medio de cultivo para infecciones oportunistas. La septicemia resultante de las infecciones es la principal causa de muerte en la mayoría de los pacientes con quemaduras graves.

El uso de enzimas proteolíticas y de agentes químicos para efectuar un desbridamiento temprano del tejido desvitalizado no ha dado lugar a un desbridamiento satisfactorio. Se encontró que los agentes químicos tales como el ácido tánico, el ácido salicílico y el ácido pirúvico causaban un daño adicional a los tejidos ya lesionados.

Se han descrito enzimas proteolíticas, incluyendo, pinguinaina, tripsina, fibrinolisina y estreptocinasa como agentes de desbridamiento. La patente de EE.UU. nº 5.505.943 desvela composiciones que contienen una proteasa producida por microorganismos del género Vibrio para tratar heridas hidrolizando los componentes del tejido necrótico.

Sin embargo, el desbridamiento con enzimas proteolíticas purificadas adolece de diversos inconvenientes, ya que las enzimas purificadas requieren numerosas aplicaciones durante un largo periodo de tiempo, muestran poca eficacia, tienen efectos secundarios tóxicos y no tienen selectividad.

Se ha averiguado que los extractos derivados del tallo de la planta de la piña (Ananas comosus) eliminan selectivamente el tejido desvitalizado. Dichos extractos, también denominados bromelaína, contienen varias enzimas proteolíticas e hidrolíticas.

La patente de EE.UU. nº 4.197.291 desvela un producto enzimático obtenido a partir de bromelaína capaz del desbridamiento de tejido desvitalizado de un hospedador mamífero, el producto enzimático comprende una proteína termolábil soluble en agua que está exenta de actividad caseinolítica y tiene un pico del punto isoeléctrico de aproximadamente 6. La proteína comprende al menos dos subunidades, teniendo cada una de ellas un peso molecular desde aproximadamente 14, 3 hasta 15 kDa, con un pico de absorción característico en la región ultravioleta del espectro a 280 nm. El procedimiento para preparar dicho producto enzimático según se desvela en la patente de EE.UU. nº 4.197.291 comprende la precipitación de la proteína con acetona, la extracción del precipitado con un tampón de acetato que contiene ácido tioglicólico, la filtración de la disolución a través de una membrana con un corte de peso molecular de aproximadamente 50 kDa, la filtración en gel del filtrado y un isoelectroenfoque. El producto enzimático así preparado contiene al menos dos, más probablemente tres, subunidades con un peso molecular desde 14, 3 hasta 15 kDa. La patente de EE.UU. nº 4.226.854 desvela un procedimiento para el desbridamiento de tejido desvitalizado usando el producto enzimático desvelado en la patente de EE.UU. nº

4.197.291.

La patente de EE.UU. nº 4.329.430 desvela adicionalmente una mezcla de enzimas proteolíticas derivada de la bromelaína útil para diseccionar y digerir tejido desvitalizado. La mezcla de enzimas proteolíticas, que es termolábil y soluble en agua, contiene escarasa, una enzima hidrolítica exenta de actividad caseinolítica con un punto isoeléctrico de aproximadamente 6, que comprende al menos dos subunidades, cada una de las cuales tiene un peso molecular desde aproximadamente 14, 3 hasta 50 kDa, ya que la mezcla enzimática se filtra a través de una membrana con un corte de peso molecular de 50 kDa y se concentra sobre una membrana con un corte de peso molecular de 30 kDa. Los resultados reproducibles obtenidos con la mezcla de enzimas proteolíticas son debidos aparentemente al hecho de que la mezcla enzimática no contiene un inhibidor, que aparentemente estaba presente en las preparaciones de enzimas proteolíticas publicadas previamente. Sin embargo, no hay ningún criterio para la detección de la actividad de este inhibidor.

La patente de EE.UU. nº 4.307.081 desvela un procedimiento para diseccionar y digerir tejido desvitalizado, que comprende poner en contacto el tejido con la mezcla de enzimas proteolíticas desvelada en la patente de EE.UU. nº

4.329.430.

La planta de la piña ha sido la fuente de diversas enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº

5.106.621 desvela proteinasas de cisteína purificadas derivadas de material de la planta de la piña con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa y que muestran actividad frente a un sustrato de cumarilamida. Particularmente, la patente de EE.UU. nº 5.106.621 se refiere a las proteinasas de cisteína ananaína y comosaína, que muestran diferentes características físicoquímicas que las distinguen de la bromelaína del tallo. Una proteasa purificada activada por tiol con un peso molecular de aproximadamente 17 kDa a 21 kDa, denominada a-bromelaína, se desvela en la patente de EE.UU. nº 5.387.517, y se muestra que tiene actividad de desbridamiento. Además, la bromelaína contiene una fosfatasa ácida y una peroxidasa, y puede contener actividad de amilasa y de celulasa. La patente de EE.UU. nº 6.335.427 enseña la purificación de una proteína de 25 kDa a partir de bromelaína, se ha encontrado que la proteína tiene actividad antineoplásica.

Perlstein y Kezdy (J. Supramol. Struct. 1: 249-254, 1973) identificaron siete inhibidores de la proteasa estrechamente relacionados, es decir, los inhibidores de la bromelaína I-VII, a partir de un polvo comercial de acetona de bromelaína. Se demostró que los inhibidores tenían unos pesos moleculares de 5000 -6000 Dalton y que contenían 50 residuos de aminoácidos y cinco puentes de disulfuro (Perlstein y Kezdy, ibid) . El análisis de la estructura primaria de uno de los siete inhibidores reveló una amplia microheterogeneidad (Reddy, M. N. y col. J. Biol. Chem.

250: 1741-1750, 1975) .

La patente de EE.UU. nº 5.830.739 desvela procedimientos para preparar una mezcla estable de escarasa y otras enzimas proteolíticas a partir de bromelaína, que comprende extraer la bromelaína con una disolución diluida de ácido ascórbico, seguido de la precipitación de la escarasa y otras enzimas proteolíticas con sulfato amónico. La patente de EE.UU. nº 5.830.739 enseña adicionalmente que el precipitado de sulfato amónico puede lavarse con agua destilada sobre un ultrafiltro de 10 kDa. Se encuentra que el procedimiento para preparar la mezcla estable de escarasa rinde mayores cantidades de escarasa. Sin embargo, no hay ninguna indicación de que la mezcla esté desprovista de inhibidores de la bromelaína.

Se encontró que las distintas enzimas purificadas aisladas a partir de bromelaína no eran tan eficaces en el desbridamiento de tejidos no viables como la mezcla de enzimas proteolíticas obtenida a partir de la bromelaína. Sin embargo, se encontró que la mezcla de enzimas proteolíticas obtenida a partir de la bromelaína, que contiene proteínas con unos pesos moleculares de hasta 50 kDa, incluyendo inhibidores de la bromelaína, no era tan eficaz en el desbridamiento de tejidos no viables como una mezcla enzimática obtenida a partir de bromelaína que contenía proteínas con unos pesos moleculares de 30 a 50 kDa, que presumiblemente estaba desprovista de los inhibidores.

Dado que dichas mezclas enzimáticas están destinadas al uso clínico en seres humanos, existe una... [Seguir leyendo]

1. Una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína, comprendiendo la composición de desbridamiento enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, estando dicha composición sustancialmente desprovista de inhibidores de la bromelaína.

2. La composición de desbridamiento según la reivindicación 1, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 10% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

3. La composición de desbridamiento según la reivindicación 2, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 5% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

4. La composición de desbridamiento según la reivindicación 3, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 2% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

5. La composición de desbridamiento según la reivindicación 4, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 1% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

6. La composición de desbridamiento según la reivindicación 1 consistente esencialmente en un único pico proteico tras una elución desde una columna de HPLC de exclusión por tamaños TSK-Gel 3000SWXL, constituyendo el único pico proteico proteínas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa.

7. La composición de desbridamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1a6que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Un procedimiento para obtener una composición de desbridamiento a partir de bromelaína, comprendiendo la composición de desbridamiento enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, estando dicha composición sustancialmente desprovista de inhibidores de la bromelaína, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

(a) suspender la bromelaína en una disolución ácida que comprende opcionalmente un antioxidante, teniendo la disolución ácida un pH en el intervalo desde aproximadamente 2, 4 hasta aproximadamente 4;

(b) ajustar la suspensión de (a) a un pH en el intervalo desde aproximadamente 2, 4 hasta aproximadamente 43, 5;

(c) añadir un coadyuvante de filtrado a la suspensión de (b) ;

(d) filtrar la suspensión de (c) para eliminar los componentes insolubles;

(e) añadir a la disolución filtrada de (d) una sal de sulfato amónico para conseguir una saturación de sulfato amónico en el intervalo desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 50%;

(f) ajustar la suspensión de (e) a un pH desde aproximadamente 2, 5 hasta aproximadamente 43, 5;

(g) incubar la suspensión de (f) a 3°C -10°C;

(h) centrifugar la suspensión de (g) para conseguir un precipitado de sulfato amónico;

(i) disolver el precipitado de sulfato amónico en una disolución ácida que comprende opcionalmente un antioxidante con un pH en el intervalo desde aproximadamente 2, 4 hasta aproximadamente 4;

(j) filtrar la disolución de (i) de forma que se retengan las enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares en un exceso de aproximadamente 10 kDa; y

(k) liofilizar la disolución retenida de (j) .

9. El procedimiento para obtener una composición de desbridamiento a partir de bromelaína según la reivindicación 8 que comprende las siguientes etapas:

(a) suspender la bromelaína en ácido acético 0, 3 M que comprende un 1% de ácido ascórbico y n-octanol con un pH desde aproximadamente 2, 4 hasta aproximadamente 2, 6;

(b) ajustar la suspensión de (a) a un pH en el intervalo desde aproximadamente 2, 5 hasta aproximadamente 3, 5;

(c) añadir un coadyuvante de filtrado que comprende sílice a la suspensión de (b) ;

(d) filtrar la suspensión de (c) a través de un filtro prensa para eliminar los componentes insolubles;

(e) añadir a la disolución filtrada de (d) una sal de sulfato amónico (285 g/L) para conseguir una saturación del 40% de sulfato amónico;

(f) ajustar la suspensión de (e) a un pH desde aproximadamente 2, 5 hasta aproximadamente 3, 5;

(g) incubar la suspensión de (f) durante aproximadament.

12. 24 horas a 4°C;

(h) centrifugar la suspensión de (g) para conseguir un precipitado de sulfato amónico;

(i) disolver el precipitado de sulfato amónico en ácido acético 0, 3 M que comprende un 1% de ácido ascórbico con un pH desde aproximadamente 2, 4 hasta aproximadamente 2, 6;

(j) filtrar la disolución de (i) a través de un ultrafiltro de 10 kDa, de forma que se retengan las enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares en un exceso de aproximadamente 10 kDa;

(k) filtrar la disolución retenida de (j) para conseguir una disolución estéril; y

(I) liofilizar la disolución filtrada de (k) .

10. Uso de una composición de desbridamiento obtenida a partir de bromelaína para la elaboración de un medicamento para tratar una herida mediante el desbridamiento de tejidos no viables, comprendiendo la composición de desbridamiento enzimas proteolíticas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa, estando dicha composición sustancialmente desprovista de inhibidores de la bromelaína.

11. El uso de la composición de desbridamiento según la reivindicación 10, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 10% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

12. El uso de la composición de desbridamiento según la reivindicación 11, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 5% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

13. El uso de la composición de desbridamiento según la reivindicación 12, en la que los inhibidores de la 10 bromelaína son menos del 2% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

14. El uso de la composición de desbridamiento según la reivindicación 13, en la que los inhibidores de la bromelaína son menos del 1% p/p del contenido proteico de dicha composición de desbridamiento.

15. El uso de la composición de desbridamiento según la reivindicación 10, en la que la composición de desbridamiento consiste esencialmente en un único pico proteico tras una elución desde una columna de HPLC de

exclusión por tamaños TSK-Gel 3000SWXL, constituyendo el único pico proteico proteínas con unos pesos moleculares de aproximadamente 23 kDa.

16. El uso de la composición de desbridamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en la que la composición de desbridamiento comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

17. El uso de la composición de desbridamiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en la que la

herida se elige del grupo formado por quemaduras heridas por quemaduras con un espesor total y parcial, quemaduras solares, quemaduras por congelación, lesiones ulcerosas, úlceras de presión (decúbito) , úlceras varicosas, úlceras por estasis, úlceras tróficas, heridas asociadas a procedimientos quirúrgicos, amputación, incisión, circuncisión y episiotomía, heridas traumáticas y piógenas, vaginitis, cervicitis, heridas por quistes pilonidales, tejido cicatrizal de cataratas y zonas de injertos cutáneos.