Combinación de glicoisoformas para el tratamiento o la prevención de la septicemia, línea celular transgénica que produce glicoisoformas de eritropoyetina, composición farmacéutica que comprende dicha combinación, procedimiento para obtener la línea celular, procedimiento para producir la combinación de glicoisoformas y procedimientos para el tratamiento y la prevención de la septicemia.

Combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichasglicoisoformas pueden comprender una cantidad de ácido siálico deentre 4 a 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetinala,

la combinación de glicoisoformas se puede usar para eltratamiento o prevención de la septicemia/sepsis, una composiciónfarmacéutica que comprende a dicha combinación, una línea celular productora de una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, procedimientos para obtener la línea celular, procedimiento para producir dicha combinación de glicoisoformas y métodos de tratamiento y prevención de la septicemia/sepsis.

“Combinación de glicoisoformas para el tratamiento o la prevención de la septicemia, línea celular transgénica que produce glicoisoformas de eritropoyetina, composición farmacéutica que comprende dicha combinación, procedimiento para obtener la línea

celular, procedimiento para producir la combinación de glicoisoformas y procedimientospara el tratamiento y la prevención de la septicemia”

La presente invención se refiere a una línea celular transgénica que produce una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en la que tales glicoisoformas pueden comprender una cantidad de ácido siálico que oscila de 4 a 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, la combinación de glicoisoformas para el tratamiento o la prevención de la septicemia, una composición farmacéutica que comprende tal combinación, procedimientos para obtener la línea celular, un procedimiento para producir tal combinación de glicoisoformas, y procedimientos para el tratamiento y la prevención de la septicemia.

Técnica anterior

Las modificaciones producidas por las células eucarióticas en el patrón de glicosilación de las glucoproteínas pueden afectar a algunas de sus propiedades biológicas, tal como su transporte, secreción, estabilidad e interacción con otras moléculas y con los receptores (Witter, A. y Howard, S., Biochem. 29: 4175-4180, 1990; Hart, Curr. Op. Cell Biol. 4: 1017-1023, 1992; Gooche et al., Bio/Technology 9: 1347-1355, 1991; Parekh et al., Curr. Op. Cell. Biol.

1: 750-754, 1991; Bevilacqua, M. y Nelson, R., J. Clin. Invest. 91: 379-387, 1993; Nelson et al., J. Clin. Invest. 91:

1157-1166, 1993; Norgard, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1068-1072, 1993; Imai et al., Nature 361: 555-557, 20 1993) .

En sus formas naturales y recombinantes (producidas en líneas celulares eucarióticas transgénicas) , la eritropoyetina humana (EPO) —una proteína usada de forma generalizada para la estimulación de la eritropoyesis— contiene cuatro cadenas oligosacáridas complejas unidas a la cadena polipeptídica. Tres de tales uniones son del tipo N y una es del tipo O. Su ubicación específica es bien conocida (Elliott, S. et al., The Journal of Biological 25 Chemistr y 279 (16) : 16854-16862, 2004; Watson et al., Glycobiology 4 (2) : 227-237, 1994) . Los oligosacáridos con uniones de tipo N puede contener un número variables de residuos terminales de ácido siálico, hecho que afecta notablemente la actividad de la EPO (Egrie, J. y Browne, J., Br. J. Cancer 84 (1) : 3-10, 2001; Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249: 4202-4206, 1974) . Por ejemplo, una cantidad mayor de ácido siálico alarga la vida media de la EPO en la sangre, pero reduce la afinidad debido al receptor relacionado con su actividad hematopoyética. En 30 cambio, una EPO con contenido de ácido siálico menor o inexistente tiene baja vida media in vivo y un nivel de afinidad elevado debido a su receptor relacionado con su actividad hematopoyética (Fukuda et al., Blood 73: 84-89, 1989; Spivak, J. y Hogans, B., Blood 73: 90-99, 1989; Imai et al., Eur. J. Biochem. 194: 457-462, 1990; Higuchi et al.,

J. Biol. Chem. 267 (11) : 7703-7709, 1991) . Para actuar como estimulante de la eritropoyesis in vivo, la EPO debe estar presente continuamente en la sangre en concentraciones adecuadas y, por lo tanto, un tiempo de vida in vivo prolongado aumenta notablemente su acción eritropoyética. En cambio, cuando está presente in vivo en concentraciones elevadas periodos cortos, tiene un efecto protector en los tejidos (Morishita, E. et al.; Neuroscience 76: 105-116, 1997) , hecho que sugiere que la EPO con niveles bajos o inexistentes de ácido siálico es útil para la inducción de la protección tisular sin ningún efecto eritropoyético consiguiente. Esto sería muy significativo, dado que el aumento de glóbulos rojos en la sangre puede ser muy arriesgado. Por otra parte, si la EPO no contiene ácido siálico (asialo-EPO) , su vida media in vivo es excesivamente corta y, por lo tanto, no es útiles ni para la estimulación de la eritropoyesis ni para la protección tisular.

Se sabe que la EPO recombinante producida en líneas celulares eucarióticas es una combinación de especies moleculares que comparten la misma cadena polipeptídica pero tienen cantidades diferentes de ácido siálico terminal presente en las cadenas oligosacáridas. Estas diversas formas de EPO se denominan glicoisoformas de 45 EPO. Dado que estas glicoisoformas de EPO tienen cargas diferentes, cada una puede ser aislada del resto mediante, por ejemplo, la técnica de isoelectroenfoque. La mezcla de glicoisoformas de EPO producida por las células recombinantes puede variar según la línea celular en uso. Por ejemplo, cuando se produce la EPO en células CHO, las glicoisoformas contienen de 1 a 14 moléculas de ácido siálico.

Más allá del uso práctico de la EPO en la estimulación de la eritropoyesis, y principalmente debido a su efecto 50 protector en los tejidos, se ha propuesto la EPO como principio activo en el tratamiento de diversas anomalías y enfermedades. Por ejemplo, la solicitud de patente de Baker et al., US nº 2004/0198663, divulga un procedimiento para reducir los efectos de la isquemia miocárdica y su daño asociado mediante la administración de cantidades efectivas de eritropoyetina. El documento de patente de Weiss, S. et al., US nº 6165783, divulga un procedimiento para inducir la diferenciación de células madre neurales o tratar enfermedades neurodegenerativas mediante la 55 aplicación de cantidades efectivas de eritropoyetina. La solicitud de patente de Zaharia, V., US nº 2002/0169129, divulga un procedimiento que comprende la administración de una dosis efectiva de EPO recombinante humana para mejorar la calidad de vida de un paciente. La solicitud de patente de Campana W. M. et al., US nº 2004/0018978, divulga un procedimiento para el tratamiento naturopático del dolor y para la protección del sistema nervioso periférico que comprende la administración de eritropoyetina. La patente estadounidense nº 6268336 divulga un procedimiento para tratar enfermedades hepáticas que comprende la administración de eritropoyetina. El documento de patente WO 03/057242 de Van Gilst, W. H. et al., divulga el uso de eritropoyetina para el tratamiento o la prevención de insuficiencias cardiacas. La patente estadounidense nº 6784154, de Westenfelder, Ch., divulga un procedimiento para la protección renal y para el tratamiento de la insuficiencia renal isquémica aguda que comprende la administración de eritropoyetina. El documento de patente WO 04/012759 de Haller H. et al., divulga el uso de la eritropoyetina para la estimulación, la movilización, la proliferación y la diferenciación de células madre endoteliales.

Durante muchos años, los investigadores se centraron en obtener eritropoyetinas con niveles elevados de ácido siálico para garantizar una vida media elevada en plasma, aumentando, por ejemplo, los sitios de glicosilación o enriqueciendo las glicoisoformas de eritropoyetina con niveles elevados de ácido siálico (véase la patente estadounidense nº 5856298, de Strickland, T. W.) . En la patente estadounidense nº 6673575, de Franze R. et al., se describe otro procedimiento para aumentar la glicosilación; y en el documento de patente WO 03/080852 se divulga un procedimiento cromatográfico para producir eritropoyetina de alta pureza con un perfil deseado de glicoisoforma.

Por otra parte, el documento de patente estadounidense nº 6531121, de Bines, M. et al., divulga la administración de asialo-eritropoyetina para la protección y el mantenimiento de la viabilidad celular, tisular o de órganos, demostrando que la actividad de la asialo-eritropoyetina (asialo-EPO) es diferente de la de las descritas previamente.

La sepsis o septicemia es la respuesta sistémica a la infección. En ocasiones, esta respuesta puede agravarse y afectar las funciones de órganos tales como los riñones, el hígado, el corazón, los pulmones, los intestinos, el 20 páncreas, el SNC, las glándulas suprarrenales y la médula ósea. También puede alterar el metabolismo, la coagulación, el sistema inmunológico, la perfusión regional de los órganos y la circulación sistémica, causando un choque séptico. La mortalidad séptica aumenta con una tasa directamente proporcional a la presencia y la gravedad del choque, y al número de las insuficiencias de órganos, oscilando entre el 30% si no hay implicada ninguna insuficiencia y el 100%, en el caso de que ocurran insuficiencias en cuatro o más órganos (Fr y , D. E., Pearlstein, L., 25 Fulton, R. L. et al., Multiple System Organ Failure. The Role of Uncontrolled Infection, Arch. Surg. 115: 136-140, 1980) . A pesar de los desarrollos logrados hasta... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina que comprende una cantidad entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, que contiene 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, que contiene 5 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, que contiene 6 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, que contiene 7 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, que contiene 8 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9, que contiene 9 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10, que contiene 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, y en la que dicha eritropoyetina es eritropoyetina humana.

2. La combinación según la reivindicación 1 en la que dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina tiene un perfil de puntos isoeléctricos entre 4 y 5, 3 y un perfil de pesos moleculares que oscila entre 32 y 34 kD.

3. Una línea celular transgénica que produce glicoisoformas de eritropoyetina según la reivindicación 1, siendo

dicha línea celular la línea celular AB2H52, depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 15 und Zellkulturen) , con número de acceso DSM ACC2727.

4. La línea celular según la reivindicación 3, produciendo y liberando al medio dicha línea celular una combinación de glicoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1, comprendiendo dicha combinación una cantidad entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, que contiene 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, que contiene 5 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y

34% de la glicoisoforma 6, que contiene 6 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, que contiene 7 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, que contiene 8 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9, que contiene 9 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10, que contiene 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, y en la que dicha eritropoyetina es eritropoyetina humana.

5. La línea celular según la reivindicación 4 en la que dicha combinación de eritropoyetina tiene una actividad adecuada para el tratamiento de la septicemia.

6. La línea celular según la reivindicación 4 en la que dicha combinación de eritropoyetina es un agente

seleccionado del grupo constituido por un agente activo adecuado para el tratamiento de la septicemia y un 30 agente activo adecuado para la prevención de la septicemia.

7. La línea celular según la reivindicación 4 en la que dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina tiene un perfil de puntos isoeléctricos entre 4 y 5, 3 y un perfil de pesos moleculares que oscila entre 32 y 34 kD.

8. Una composición farmacéutica adecuada para el tratamiento y la prevención de la septicemia que comprende una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 como agente activo, en la que dicha 35 combinación comprende una cantidad entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, que contiene 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, que contiene 5 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, que contiene 6 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, que contiene 7 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, que contiene 8 moléculas de ácido

siálico por molécula de eritropoyetina, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9, que contiene 9 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10, que contiene 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y excipientes farmacéuticamente aceptables, y en la que dicha eritropoyetina es eritropoyetina humana.

9. La composición según la reivindicación 8 en la que dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina tiene 45 un perfil de puntos isoeléctricos entre 4 y 5, 3 y un perfil de pesos moleculares que oscila entre 32 y 34 kD.

10. La composición según la reivindicación 8 en la que los excipientes se seleccionan del grupo constituido por conservantes, estabilizantes, diluyentes y combinaciones de los mismos.

11. La composición según la reivindicación 8, estando dicha composición en forma de píldoras, cápsulas,

masticables, comprimidos, comprimidos efervescentes, soluciones inyectables, partículas y soluciones 50 sublinguales.

12. Un procedimiento para obtener la combinación de la glicoisoforma de eritropoyetina de la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

a. Cultivar en un medio de cultivo la línea celular AB2H52, depositada en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) con número de acceso DSM ACC2727, teniendo dicho medio de cultivo una osmolalidad que oscila entre 310 y 450 miliosmol/kg de disolvente y aditivos seleccionados del grupo constituido por N-acetilglucosamina, cloruro amónico, cloruro sódico y combinaciones de los mismos, y

b. Purificar y aislar la combinación de la glicoisoforma de eritropoyetina producida.

13. El procedimiento según la reivindicación 12 en el que la N-acetilglucosamina presente en el medio de cultivo oscila entre 1 and 100 mM; la cantidad de cloruro amónico presente en el medio de cultivo está entre 1 and 5 mM, y el cloruro sódico está presente en el medio de cultivo en una cantidad entre 10 and 75 mM.

14. El procedimiento según la reivindicación 12 en el que la etapa b) de purificación y aislamiento comprende al menos una etapa cromatográfica.

15. Una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 que comprende una cantidad entre 2

y 12% de la glicoisoforma 4, que contiene 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, que contiene 5 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, que contiene 6 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, que contiene 7 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, que contiene 8 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 2 y

23% de la glicoisoforma 9, que contiene 9 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10, que contiene 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, en la que dicha eritropoyetina es eritropoyetina humana, para su uso como composición farmacéutica en el tratamiento de la septicemia.

16. La combinación según la reivindicación 15 en la que dicha composición farmacéutica se usa mediante 20 administración parenteral, oral, sublingual o intranasal.

17. La combinación según la reivindicación 15 que comprende también el uso de antibióticos, el aumento del volumen plasmático con cristaloides, el aumento del volumen plasmático con coloides, el soporte de órganos con insuficiencias que incluye el control del choque, el control estricto de la glucemia, la regulación de la inflamación, la regulación de la respuesta procoagulante y combinaciones de los mismos.

18. La combinación según la reivindicación 15 en la que dicha composición farmacéutica se usa en dosis entre 10 y 1000 μg/kg.

19. La combinación según la reivindicación 15 en la que dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina tiene un perfil de puntos isoeléctricos entre 4 y 5, 3 y un perfil de pesos moleculares que oscila entre 32 y 34 kD.

20. Una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 que comprende una cantidad entre 2

y 12% de la glicoisoforma 4, que contiene 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, que contiene 5 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, que contiene 6 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, que contiene 7 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, que contiene 8 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, entre 2 y

23% de la glicoisoforma 9, que contiene 9 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10, que contiene 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, en la que dicha eritropoyetina es eritropoyetina humana, para su uso como composición farmacéutica en la prevención de la septicemia.

21. La combinación según la reivindicación 20 en la que dicha composición farmacéutica se usa mediante 40 administración parenteral, oral, sublingual o intranasal.

22. La combinación según la reivindicación 20 que comprende también el uso de antibióticos, el aumento del volumen plasmático con cristaloides, el aumento del volumen plasmático con coloides, el soporte de órganos con insuficiencias que incluye el control del choque, el control estricto de la glucemia, la regulación de la inflamación, la regulación de la respuesta procoagulante y combinaciones de los mismos.

23. La combinación según la reivindicación 20, usándose dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina en dosis entre 10 y 1000 μg/kg.

24. La combinación según la reivindicación 20, teniendo dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina un perfil de puntos isoeléctricos entre 4 y 5, 3 y un perfil de pesos moleculares que oscila entre 32 y 34 kD.

25. El uso de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 para fabricar un fármaco 50 para el tratamiento de la septicemia.

26. El uso de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 para fabricar un fármaco para la prevención de la septicemia.