Célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que produce un compuesto precursor de isoprenoide ocompuesto isoprenoide a través del mecanismo del mevalonato,

en la que dicha célula es modificadagenéticamente para comprender:

a) un ácido nucleico heterólogo integrado en el cromosoma de la célula huésped que codifica una 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece de un dominio que comprende la membrana yque mantiene su dominio catalítico C-terminal;

b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heteróloga integrada en el cromosoma de la célula huésped paraincrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; y

c) un ácido nucleico heterólogo integrado en el cromosoma de la célula huésped para disminuir el nivel deactividad de la escualeno sintasa;

en la que la célula huésped comprende además una sesquiterpeno sintasa heteróloga y es capaz de producir unisoprenoide que deriva de la acción de dicha sesquiterpeno sintasa, y

en la que las modificaciones genéticas proporcionan la producción del isoprenoide derivado de la acción de dichasesquiterpeno sintasa a un nivel que es por lo menos el 50% superior al nivel del isoprenoide en una célula decontrol que no comprende las modificaciones genéticas.

CELULAS HUESPED MODIFICADAS GENETICAMENTE Y USO DE LAS MISMAS PARA PRODUCIR COMPUESTOS ISOPRENOIDES CAMPO DE LA INVENCION [0001] La presente invencion se encuentra en el campo de la produccion de compuestos isoprenoides y, en particular, celulas huesped que son modificadas geneticamente para producir compuestos isoprenoides. ANTECEDENTES DE LA INVENCION [0002] Los isoprenoides constituyen un grupo extremadamente amplio y diverso de productos naturales que tienen un origen biosintetico comun, es decir, un unico precursor metabolico, isopentenil difosfato (IPP) . Los compuestos isoprenoides tambien se refieren como "terpenos" o "terpenoides". Se han descrito alrededor de

40.000 isoprenoides. Por definicion, los isoprenoides estan formados de las denominadas unidades de isopreno (C5) . El numero de atomos de C presentes en los isoprenoides es normalmente divisible por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40) , aunque se han descrito isoprenoides irregulares y politerpenos. Los miembros importantes de los isoprenoides incluyen carotenoides, sesquiterpenoides, diterpenoides, y hemiterpenos. Los carotenoides incluyen, por ejemplo, licopeno, β-caroteno, y similares, muchos de los cuales actuan como antioxidantes. Los sesquiterpenoides incluyen, por ejemplo, artemisinina, un compuesto que tiene actividad contra la malaria. Los diterpenoides incluyen, por ejemplo, taxol, un agente quimioterapeutico contra el cancer. [0003] Los isoprenoides comprenden la familia mas numerosa y estructuralmente diversa de productos naturales. En esta familia, los terpenoides aislados de plantas y otras fuentes naturales se utilizan como compuestos de aromas y fragancias comerciales, asi como farmacos contra la malaria y el cancer. Una mayoria de los compuestos terpenoides que se utilizan actualmente son productos naturales o sus derivados. Los organismos de origen (por ejemplo, arboles, invertebrados marinos) de muchos de estos productos naturales no son susceptibles de un cultivo a gran escala necesario para producir cantidades comercialmente viables ni de manipulacion genetica para una mayor produccion o derivatizacion de estos compuestos. Por lo tanto, los productos naturales deben producirse semisinteticamente a partir de analogos o sinteticamente utilizando sintesis quimica convencional. Ademas, muchos productos naturales presentan estructuras complejas y, como resultado, son actualmente caros o imposibles de sintetizar. Dichos productos naturales deben extraerse de sus fuentes nativas, tales como arboles, esponjas, corales y microbios marinos; o producirse sinteticamente o semisinteticamente a partir de precursores abundantes. La extraccion de un producto natural a partir de una fuente nativa esta limitada por la disponibilidad de la fuente nativa; y la produccion sintetica o semisintetica de productos naturales puede sufrir un rendimiento bajo y/o un coste elevado. Dichos problemas de produccion y disponibilidad limitada de la fuente natural pueden limitar el desarrollo comercial y clinico de dichos productos. [0004] La biosintesis de productos naturales de isoprenoides en celulas huesped modificadas podria aprovechar el potencial comercial y terapeutico sin explotar de estos recursos naturales y producir productos de quimica fina y farmaceuticos menos caros y mas ampliamente disponibles. El obstaculo principal para la biosintesis de terpenoides a nivel elevado es la produccion de precursores de terpenos. En Saccharomyces cerevisiae, l mecanismo del mevalonato proporciona la produccion de isopentenil difosfato (IPP) , que se puede isomerizar y polimerizar en isoprenoides y terpenos de valor comercial. Tambien se producen otros precursores valiosos, incluyendo farnesil difosfato (FPP) y geranilgeranil difosfato (GPP) . Sin embargo, mucho del flujo de reaccion esta dirigido hacia las posteriores etapas no deseadas del mecanismo de esterol, dando lugar a la produccion de ergosterol. [0005] Existe la necesidad en la tecnica de celulas huesped mejoradas productoras de isoprenoides y precursoras de isoprenoides que proporcionen una produccion a nivel elevado de compuestos isoprenoides, asi como de los precursores de poliprenil difosfato de dichos compuestos. La presente invencion esta dirigida a esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. Literatura [0006] Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/005678; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21 (7) :796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182 (15) : 4319-27; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63:3341-3344; Jackson et al (2003) Organ. Lett. 5:1629-1632; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0072323; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0029239; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0110259; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0063182; Patente de Estados Unidos No. 5, 460, 949; Publicacion de patente de Estados Unidos No. 2004/0077039; Patente de Estados Unidos No. 6, 531, 303; Patente de Estados Unidos No. 6, 689, 593; Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (4) : 931-934; T. Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491; Brock et al (2004) Eur J. Biochem. 271: 3227-3241; Choi, et al (1999) Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368; Parke et al., (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974-2983; Subrahmanyam et al (1998) J. Bact. 180: 4596-4602; Murli et al. (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509; Szkopinska et al, (2000) Biochemical And Biophysical Research Communications, vol. 267, no. 1, 473-477; Kontoyiannis et al (1999) Abstract Of The Interscience Conference On Antimicrobial Agents And Chemotherapy, vol. 39, Sepiembre 1999, paginas 586-586, Wentzinger et al (2002) Plant Physiology. vol. 130, no. 1, 334 - 346, EP-0982404A1.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona una celula huesped de Saccharomyces cerevisiae que produce un precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide a traves del mecanismo de mevalonato, en el que dicha celula es modificada geneticamente para comprender: (a) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped que codifica una 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece del dominio que abarca la membrana y que mantiene su dominio catalitico C-terminal; (b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heterologa integrada en el cromosoma de la celula huesped para incrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; y (c) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped para disminuir el nivel de actividad de escualeno sintasa; donde la celula huesped comprende ademas una sesquiterpeno sintasa heterologa yes capazde producir un isoprenoide que deriva de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa, y donde las modificaciones geneticas proporcionan la produccion del isoprenoide derivado de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa a un nivel que por lo menos aproximadamente el 50% superior al nivel del isoprenoide en una celula de control que no comprende las modificaciones geneticas. Se proporcionan metodos para la produccion de un compuesto isoprenoide o un compuesto precursor de isoprenoide en dicha celula huesped. Los metodos implican generalmente cultivar dicha celula huesped modificada geneticamente bajo condiciones que promueven la produccion de niveles elevados de un compuesto isoprenoide o compuesto precursor de isoprenoide y aislar el compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide del medio de cultivo. Se hace referencia aqui a continuacion a una "celula huesped" como una celula huesped de S. cerevisiae segun la reivindicacion 1.

BREVE DESRCIPCION DE LAS FIGURAS

La figura 1 es una representacion esquematica del mecanismo de mevalonato en Saccharomyces cerevisiae. Se muestran las estructuras de los intermedios y nombres de los genes que codifican varias enzimas en el mecanismo.

La figura 2 es una representacion esquematica de una parte del mecanismo de biosintesis de esterol en un organismo que expresa amoríadieno sintasa (ADS) . Se muestran las estructuras de los intermedios y nombres de los genes que codifican varias enzimas en el mecanismo.

Las figuras 3A y 3B representan la produccion de amoríadieno por S. cerevisiae durante 96 horas de cultivo que expresa amoríadieno sintasa (ADS) (+) ; ADS y 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A reductasa (tHMGR) truncada (0) ; ADSyupc2-1 (.) ; yADSyecm22-1 (.) . Los datos se muestran como la produccion total (3A) y normalizados para la densidad celular (3B) . Los datos son las medias p desviacion estandar... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIONES

1. Celula huesped de Saccharomyces cerevisiae que produce un compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide a traves del mecanismo del mevalonato, en la que dicha celula es modificada geneticamente para comprender: a) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped que codifica una 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima-A reductasa (HMGR) truncada que carece de un dominio que comprende la membrana y que mantiene su dominio catalitico C-terminal; b) una farnesil difosfato sintasa (FPPS) heterologa integrada en el cromosoma de la celula huesped para incrementar el nivel de actividad de dicha FPPS; y c) un acido nucleico heterologo integrado en el cromosoma de la celula huesped para disminuir el nivel de actividad de la escualeno sintasa; en la que la celula huesped comprende ademas una sesquiterpeno sintasa heterologa y es capaz de producir un isoprenoide que deriva de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa, y en la que las modificaciones geneticas proporcionan la produccion del isoprenoide derivado de la accion de dicha sesquiterpeno sintasa a un nivel que es por lo menos el 50% superior al nivel del isoprenoide en una celula de control que no comprende las modificaciones geneticas.

2. Celula huesped segun la reivindicacion 1, en la que la terpeno sintasa se selecciona entre amoría-4, 11-dieno sintasa; betacariofileno sintasa; germacreno A sintasa; 8-epicedrol sintasa; valenceno sintasa; (+) -delta-cadineno sintasa; germacreno C sintasa; (E) beta-farneseno sintasa; vetispiradieno sintasa; 5-epiaristoloqueno sintasa; aristolqueno sintasa; alfa-humuleno sintasa; (E, E) -alfa-farneseno sintasa; E-alfa-bisaboleno sintasa; (E) -gammabisaboleno sintasa; longifoleno sintasa, gamma-humuleno sintasa, Delta-selineno sintasa, epi-cedrol sintasa; alfa-zingibereno sintasa; guaiadieno sintasa; cascariladieno sintasa; cis-muuroladieno sintasa; pachulol sintasa.

3. Metodo de produccion de un compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide, cuyo metodo comprende cultivar una celula huesped, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y aislar el compuesto precursor de isoprenoide o compuesto isoprenoide del medio de cultivo.