Un reactivo para detectar ARNm de -actina mediante el método de RT-LAMP,

que comprende un conjunto de cebador que comprende un cebador FIP, RIP, F3 y R3, en el que el cebador FIP comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 37, el cebador RIP comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 45, el cebador F3 comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 10 y el cebador R3 comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 31.

Cebadores para amplificación de ácido nucleico en la detección de ARNm de gen constitutivo y método de ensayo que usa estos cebadores.

Campo técnico

La presente invención se refiere a cebadores para amplificación de ácido nucleico para detectar un gen constitutivo.

Antecedentes de la técnica

Debido a avances recientes en los campos de ingeniería genética y biología molecular, se pueden diagnosticar enfermedades infecciosas o genéticas a nivel de ADN o ARN. En particular, debido al desarrollo de métodos de amplificación de ácido nucleico, incluyendo el método de la reacción en cadena de polimerasa (método de PCR:Science, 230: 1350-1354, 1985) y el método NASBA (método de Amplificación de Ácido Nucleico en base a Secuencia: Nature, 350, 91-92, 1991; Patente japonesa Nº 2648802 y Patente japonesa Nº 2650159) , la detección de una cantidad infinitesimal de ácido nucleico presente en una muestra biológica, que ha sido difícil hasta ahora, se ha vuelto posible, facilitando enormemente de ese modo los análisis genéticos.

Por ejemplo, en el campo de oncología, el diagnóstico de metástasis tumoral a los ganglios linfáticos es de enorme importancia. Como un enfoque al diagnóstico de metástasis tumoral a ganglios linfáticos, existe un método para la detección de proteína marcadora de tumor tal como citoqueratina (CK) . Debido al desarrollo reciente de tecnología de análisis genético, la detección de expresión de ARNm de proteína marcadora de tumor ha permitido el diagnóstico eficaz de tumor (The Hokkaido journal of medical science, vol. 66 (2) , págs. 135-141, 1991) . La RT-PCR ha permitido la detección de expresión de ARNm de CK en tejido extirpado y el subdiagnóstico de metástasis tumoral se puede evitar en cierta medida. Estos métodos de amplificación de ácido nucleico se han puesto en práctica en el campo del diagnóstico de tumor y cáncer (Manual of Clinical Laborator y Medicine, 31ª ed., Kanehara & Co., Ltd., publicado el 20 de septiembre de 1998) .

Como otro método de amplificación de ADN, se ha informado el método LAMP (Documento de Patente 1) . El método LAMP es un método de amplificación génica que se usa cebadores múltiples incluyendo aquellos que forman una estructura de horquilla en los extremos del producto amplificado a medida que avanza la reacción de desplazamiento de cadena. En primer lugar, en la reacción primaria, se sintetiza una estructura similar a pesa con bucles en ambos extremos a partir de ADN de molde usando un par de cebadores internos (FIP y RIP) , un par de cebadores externos (cebadores F3 y R3) y ADN polimerasa de desplazamiento de cadena. Esta estructura sirve como la estructura de partida para el ciclo de amplificación y las reacciones de alargamiento y síntesis avanzan desde el extremo 3' de la estructura usándola a ella misma como un molde. El producto amplificado está compuesto de varias estructuras de repetición, cada unidad de las cuales comprende, dentro de la cadena, las regiones complementarias enlazadas en la dirección invertida que se obtienen a partir de las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos de doble cadena que corresponden a la región amplificada entre los cebadores. El método LAMP tiene como características que la desnaturalización por calor de cadenas dobles a cadenas sencillas no es necesaria y que todas las reacciones de amplificación pueden avanzar de forma consecutiva a una temperatura fija (Documentos no de Patente 1 y 2) . De forma similar, cuando el molde es ARN, la estructura de partida se puede sintetizar añadiendo transcriptasa inversa a la composición de la solución de reacción para molde de ADN y se puede conducir la amplificación (método RT-LAMP) . El método LAMP proporciona una cantidad suficiente de producto de amplificación para la detección en aproximadamente 30 minutos. Por tanto, este método se puede aplicar al diagnóstico de metástasis tumoral a ganglios linfáticos con los fines de la determinación rápida de la estrategia terapéutica, debido a que el tiempo necesario para la detección de ácidos nucleicos es reducido. Este método también es prometedor para la aplicación a diagnóstico intraoperatorio, ya que el mismo puede dar resultados rápidos.

Para cuantificar ARNm, el ARNm de un gen constitutivo, cuyo nivel de expresión no difiere entre tejidos, se puede usar como un control interno en la muestra. El uso del ARNm de gen constitutivo como un control interno tiene la ventaja de ser capaz de detectar ARNm del gen diana de una manera relativa independientemente de la eficacia de extracción del ARNm del gen diana o la eficacia de síntesis de ADNc.

Los ejemplos del gen constitutivo incluyen el gen de -actina, un componente del citoesqueleto y gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (denominada en lo sucesivo en el presente documento "GAPDH") , una enzima principal en el sistema de glicólisis.

El desarrollo de cebadores más eficaces para amplificación de ácido nucleico se desea con respecto a los genes constitutivos usados con los fines de control interno.

(Gen de -actina) La actina es una proteína que se encuentra de forma abundante en todas las células eucariotas. Esta proteína proporciona varias funciones estructurales y reguladoras, incluyendo el papel en mitosis, motilidad y la integridad de la estructura de células eucariotas superiores. Se han identificado seis isoformas de actina en los vertebrados; cuatro de ellas son de actina de músculo (actinas de músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo liso aórtico y músculo liso de estómago) y dos de ellas son de actina no muscular (-actina citoplasmática) . Las actinas de músculo se expresan de forma específica de tejido y están implicadas en la contracción muscular. Por el contrario, las actinas citoplasmáticas se encuentran, en principio, en todas las células y están implicadas en varias funciones celulares. A pesar de su diversidad, las secuencias de aminoácidos de la actina intracelular están altamente conservadas en tres diferentes tipos de actina y entre especies de eucariotas.

La secuencia del gen de -actina citoplasmática humano ya se ha determinado y comparado con las secuencias de genes de -actinas obtenidos a partir de otras especies (Nakajima-lijima et al, PNAS 82, págs. 6133-6137 (1985) ; Solicitud de Patente EP Nº 0174608; Ponte et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, págs. 1687-1696 (1984) ) . Los cebadores para amplificación del gen de -actina humano completo están disponibles en el mercado en Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) con el nombre de MAPPING Amplimershito para -actina. También, con respecto a los oligonucleótidos que se hibridan con la secuencia de nucleótidos de -actina humana de una manera específica de especie, se ha informado que esos oligonucleótidos se usan como controles internos en la reacción para amplificación de ácido nucleico y herramientas para determinar la integridad de las muestras usadas para la amplificación de ácido nucleico (documento JP, H7-99981-A) . El documento WO 94/17086 (Apollon, Inc.; Yoon Kyonggeun; Lu Meiqing; 1994-08-04) divulga un par de cebadores de PCR para detectar ARNm de -actina.

(Gen de GAPDH)

La gliceraldehído-3-fosfato humana es uno de los intermediarios importantes implicados en el metabolismo de la glucosa, tal como glicólisis y ciclo de pentosa fosfato y lipogenésis en organismos vivos y esta sustancia está ampliamente distribuida en el organismo vivo. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana (GAPDH) también es necesaria para la síntesis de lípidos a partir de esta sustancia y esta enzima también está ampliamente distribuida in vivo en seres humanos.

El desarrollo de cebadores más eficaces para amplificación de ácido nucleico se desea con respecto a -actina y GAPDH, usados con el fin de control interno.

(Documento de Patente 1) Publicación Internacional: WO 00/28082 (folleto)

(Documento no de Patente 1) Bio-Venture, 2001, Vol. 1, Nº 1, págs. 109-115

(Documento no de Patente 2) BIO-INDUSTRY, 2001, Vol. 18, Nº 2, págs. 15-29

Divulgación de la invención Un objeto de la presente divulgación es proporcionar cebadores para amplificación de ácido nucleico para detectar ARNm de genes constitutivos, particularmente cebadores novedosos para amplificación de ARNm para los genes de

- actina y GAPDH. La presente invención se define en y mediante las reivindicaciones adjuntas.

(Medios para resolver los problemas)

Para resolver el problema... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo para detectar ARNm de -actina mediante el método de RT-LAMP, que comprende un conjunto de cebador que comprende un cebador FIP, RIP, F3 y R3, en el que el cebador FIP comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 37, el cebador RIP comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 45, el cebador F3 comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 10 y el cebador R3 comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 31.

2. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un conjunto de cebador en el que el cebador FIP consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 37, el cebador RIP consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 45, el cebador F3 consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 10 y el cebador R3 consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 31.

3. El reactivo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además un cebador que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 33.

4. El reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además un cebador que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como SEC ID Nº: 34.

15 5. El reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo además una enzima con actividad de transcriptasa inversa, sustratos de dNTP y ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena.

6. Un método para detectar ARNm de -actina, en el que se usa al menos uno de los conjuntos de cebador de las reivindicaciones 1 a 5.

20 7. Uso de al menos uno de los reactivos de las reivindicaciones 1 a 5 para un método para detectar ARNm de actina mediante método de RT-LAMP.