Biocatalizadores híbridos que comprenden Organosílices Mesoporosas Periódicas (PMO) y lipasas inmovilizados sobre los mismos.

Además, la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los mismos y al uso de dichos biocatalizadores en diferentes áreas industriales.

BIOCATALIZADORES HÍBRIDOS

La presente invención se refiere a nuevos biocatalizadores híbridos que comprenden materiales Organosílices Mesoporosas Periódicas (PMO) y enzimas inmovilizados sobre los mismos y al procedimiento de obtención de los mismos. Dichos biocatalizadores son muy estables en disolventes orgánicos o medios de reacción orgánicos.

Además la presente invención se refiere al uso de dichos biocatalizadores en diferentes áreas industriales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las lipasas son una familia de enzimas con actividad acil hidrolasa, que poseen un dominio hidrofóbico en su superficie, mediante el cual se regula el acceso de sustratos al centro activo. La inmovilización de lipasas por interacciones hidrofóbicas se lleva a cabo a través de este dominio, sobre soportes de superficie hidrofóbica. Esta inmovilización de carácter no covalente no supone modificación química para la lipasa que podría resultar en una pérdida de actividad.

Los soportes que se suelen utilizar más frecuentemente son de diferente naturaleza (polímeros orgánicos hidrofóbicos, polímeros naturales hidrofílicos funcionalizados con grupos hidrofóbicos, o materiales inorgánicos como sílice o vidrio poroso funcionalizado con grupos hidrofóbicos) . En general se utilizan materiales meso/macroporosos de estructura amoría, en los que el contacto entre la lipasa y la pared del soporte está limitado a una pequeña parte de la superficie enzimática.

Los Materiales Mesoporosos Ordenados (en adelante MMO) , de naturaleza silícea, tienen diámetros de poro entre 2 y 50 nm y ofrecen una estructura interna regular y una excelente interconexión entre el entramado poroso que facilita la difusión de sustratos y productos. La inmovilización de lipasas sobre MMO requiere la funcionalización de la superficie de la sílice con grupos hidrofóbicos. La obtención de MMO funcionalizados por co-condensación o por anclaje da lugar a superficies sobre las que van enganchados los grupos hidrofóbicos, lo que reduce el diámetro de poro. Dado que estos materiales tienen de por sí un reducido diámetro de poro, esta reducción adicional dificulta la entrada y difusión del enzima y por tanto las cargas enzimáticas que se alcanzan son demasiado bajas.

Así, el descubrimiento de las Organosílices Mesoporosas Periódicas (en adelante PMO, del inglés: Periodic Mesoporous Organosilica) [F. Hoffmann, M. Cornelius, J. Morell, M. Fröba, Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 3216], un tipo de MMO en los que la parte orgánica hidrofóbica, no está anclada sobre la superficie del material silíceo, sino que forma parte de la misma pared como especie de silicio que se entrecruza formando el esqueleto del material poroso final, abre una prometedora línea de soportes para enzimas.

Tras el primer estudio de J. F. Díaz, K. J. Balkus Jr., J. Mol. Catal. B: Enzymatic 2 (1996) 115, se ha tratado de inmovilizar muchos enzimas por adsorción física en MMO [H. P. Yiu, P. A. Wright, J. Mat.Chem. 15 (2005) 3690; M. Hartmann, Chem. Mater. 17 (2005) 4577]. En el caso particular de lipasas, aunque se han alcanzado algunos resultados prometedores, aún hay mucho por mejorar tanto en carga como en estabilidad y lixiviado. Por las dimensiones de la lipasa (generalmente alrededor de 4nm) se prevé que quepa bien en un MMO común, si bien el confinamiento no conlleva ventajas en cuanto al proceso de inmovilización en sí. En estudios previos en nuestro laboratorio hemos analizado el efecto de un leve grado de hidrofobicidad incluido como grupos metilo anclados a la sílice sobresaliendo de las paredes de los poros. Los resultados nos permitieron concluir que aunque tienen una influencia positiva marcada en la prevención de la lixiviación de la lipasa cuando se suspenden en medios acuosos, el injerto de MMO con las cadenas hidrofóbicas reduce el diámetro de los poros y puede obstaculizar la difusión del enzima. [E. Serra, A.

Mayoral, Y. Sakamoto, R. M. Blanco, I. Díaz, Micropor. Mesopor. Mater. 114 (2008) 201]. Por ejemplo, el material silíceo mesoporoso conocido como FDU12 funcionalizado con grupos octilo precisa de altas presiones para alcanzar un confinamiento eficiente de la enzima en el interior de sus cajas mesoporosas [Y. Han, S. S. Lee, J. Y. Ying, Chem Mater. 18 (2006) 643]. Sin embargo, esta estrategia es difícil de generalizar pues requiere el embalaje del MMO en una columna cromatográfica. El anclaje de grupos butílicos ha resultado menos eficaz llevando a cargas incluso más bajas que las contrapartes silíceas, de nuevo probablemente debido a la reducción adicional del tamaño de poro en un material que ya tenía de por sí un diámetro muy ajustado para la lipasa [A. Galarneau, M. Mureseanu, S. Atger, G. Renard, F. Fajula, New J. Chem 30 (2006) 562].

Así, la conclusión inmediata, es la necesidad de diseñar soportes hidrofóbicos (al menos para la lipasa) que presenten estructuras porosas regulares con alta conectividad y volumen de poro, con dominios hidrofóbicos abundantes sin comprometer el diámetro de poro. En este sentido, el descubrimiento reciente de los PMO, con los grupos orgánicos formando parte de la sílice que condensa estructurando el material, ha proporcionado nuevas oportunidades para la inmovilización de la enzima. En la bibliografía sólo se han encontrado algunos estudios preliminares haciendo uso de PMO's como soportes de enzimas, y ninguno de ellos con lipasa. Se ha empleado un PMO basado en puentes etano como soporte de citocromo c y xilanasa sin observarse mejora en la carga ni en el lixiviado de la enzima en comparación con pura sílice SBA15 [S. Z. Qiao, C. Z. Yu, W. Xing, Q. H. Hu, H. Djojoputro, G. Q. Lu, Chem. Mater. 17 (2005) 6172;. S. Hudson, E. Magner, J. Cooney, B. K. Hodnett, J. Phys. Chem. B 109 (2005) 19496].

También se pueden encontrar esfuerzos en fabricar paredes más hidrofóbicas para fijar lisozima empleando PMO bifuncionalizados con diversas fracciones de grupos dietilenbenceno y etano [C. Li, J. Liu, X. Shi, J. Yang, Q. Yang, J. Phys. Chem. C 111 (2007) 10948], o mezclas de propilamina, benceno y bifenilo [M. Park, S. S. Park, M. Selvaraj, D. Zhao, C-S. Ha, Micropor. Mesopor. Mater. 124 (2009) ].

DESCRIPCION DE LA INVENCION

En la presente invención, la novedosa utilización de PMO con puentes etileno como soportes para la inmovilización de lipasa nos ha permitido alcanzar cargas enzimáticas lo suficientemente altas mientras que la eficiencia catalítica del biocatalizador resultante muestra excelentes valores, mayores que los obtenidos con otros catalizadores de lipasa inmovilizada bien sobre MMO funcionalizados con grupos metilo o bien sobre sílices amorías funcionalizadas con grupos octilo, de poro más ancho. Con respecto a estas últimas, la menor hidrofobicidad del grupo etilo frente al octilo está compensada en los PMO por el mayor grado de sustitución: así, mientras que las sílices amorías tienen tan solo un 6% de materia orgánica correspondiente a los octilo (medido por TGA) , en los PMO la materia orgánica es del 18%. La alta hidrofobicidad de la pared junto con el confinamiento de la enzima en los poros reduce además la flexibilidad facilitando la formación de interacciones enzima-soporte. La intensa interacción reduce la movilidad de la proteína, y por tanto ralentiza su desnaturalización. Como consecuencia, la estabilidad aumenta. Esto es especialmente interesante en medios orgánicos desnaturalizantes, como son los codisolventes solubles en agua, principalmente alcoholes y especialmente el metanol.

La obtención de biocatalizadores de lipasa inmovilizada más estables en presencia de metanol es por tanto clave de su utilización en procesos que han de ser llevados a cabo en estos medios como por ejemplo la obtención de biodiesel por vía enzimática, y es donde reside la importancia de la presente invención.

La presente invención se refiere a un nuevo tipo de biocatalizadores que consiguen solventar los problemas anteriormente enunciados y que comprenden: materiales mesoporosos ordenados del tipo de los PMO y enzimas (lipasas) inmovilizados sobre los mismos.

Además tienen las siguientes ventajas:

- son muy estables en disolventes orgánicos o en medios de reacción orgánicos, frente a otros biocatalizadores que contienen lipasa inmovilizada hidrofóbicamente.

- poros de tamaño controlado y homogéneo.

- alto grado de hidrofobicidad sin sacrificar el diámetro ni el volumen de mesoporo.

- el confinamiento de la enzima en poros de tamaño controlado maximiza la superficie de contacto hidrofóbica.

- el confinamiento más la hidrofobicidad... [Seguir leyendo]

1. Biocatalizadores híbridos que comprenden un soporte de organosílices mesoporosas periódicas y lipasas en una cantidad de al menos 5 mg por gramo del material mesoporoso.

2. Biocatalizadores híbridos según la reivindicación 1, donde las lipasas están en una cantidad de entre 5 y 100 mg por gramo de material mesoporoso

3. Biocatalizadores híbridos según las reivindicaciones 1 y 2, donde las lipasas están en una cantidad de 50 mg por gramo del material mesoporoso.

4. Biocatalizadores híbridos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el material mesoporoso tiene un tamaño de poro de 5 a 20 nm, preferiblemente de 5 a 15 nm, y más preferiblemente de 5 a 10 nm.

5. Biocatalizadores híbridos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el material mesoporoso ordenado está compuesto por unidades de organosilanos puente de fórmula general (I)

(R'O) 3Si-R-Si (OR') 3

(I)

donde R se selecciona entre alquil C1-C6, alquenil C1-C6 o cicloalquil C4-C7, y R' se selecciona entre grupos etóxido o metóxido.

6. Biocatalizadores híbridos según de la reivindicación 5, donde R se seleccionan entre alquenil C1-C6, preferiblemente un grupo etileno.

7. Biocatalizadores híbridos según la reivindicación 5, donde R' es un grupo etóxido.

8. Método para preparar los biocatalizadores híbridos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las siguientes etapas:

a. adición de una fuente de sílice a una mezcla del surfactante pluronic P123, agua, cloruro potásico y ácido clorhídrico;

b. eliminación del surfactante; y

c. adición de una disolución tampón de una lipasa sobre el material obtenido tras la etapa b

9. Método según la reivindicación 8, donde la fuente de sílice es 1, 2bis (trietoxisilil) etano.

10.Método según la reivindicación 8, donde la mezcla que se forma en la etapa a es un material de tipo organosílice mesoporosa periódica.

11.Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la mezcla procedente de la etapa a) se mantiene a temperatura ambiente durante 24 horas.

12.Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde tras la etapa a) , se calienta la mezcla durante un período de tiempo de entre 12 a 36 horas, preferiblemente durante 24, a una intervalo de temperatura de entre 50 a 200º C, preferiblemente de entre 75 y 150º C y más preferiblemente a 100º C.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la eliminación del surfactante se lleva a cabo mediante extracción con una disolución de EtOH/HCl.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde la disolución tampón está a un pH entre 3 y 9.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, donde se adiciona entre 5 y 15 ml de la disolución tampón, preferiblemente entre 7 y 12 ml.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde el material obtenido tras la etapa c, está en una cantidad desde 50 a 150 mg, preferiblemente desde 75 a 120 mg.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, donde tras la etapa e, además se llevan a cabo las siguientes etapas:

- agitación;

- filtrado y lavado de la suspensión con la disolución tamponadora de la etapa c;

- secado suspendiendo en acetona; y

- filtrado a sequedad a vacío.

18. Uso de los biocatalizadores híbridos de las reivindicaciones 1 a 7, para procesos catalizados por lipasas en medios orgánicos de reacción, para reacciones de condensación destinadas a la obtención de compuestos con utilidad en la industria farmacéutica, química fina, cosmética y alimentaria.

19. Uso de los biocatalizadores híbridos de las reivindicaciones 1 a 7, para reacciones de condensación de biocombustibles que son llevadas a cabo en disolventes o medios orgánicos de reacción.

20. Uso de los biocatalizadores híbridos según la reivindicación 19, en las reacciones de condensación de alcoholes con ácidos grasos para dar lugar a biodiesel.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201030515

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 09.04.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12N11/14 (2006.01) B01J32/00 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

16. 168. 1-20 X E. SERRA et al., "A comparative study of periodic mesoporous organosilica and different hydrophobis mesoporous silicas for lipase inmobilization", Microporous and Mesoporous Materials, 2010 [accesible en línea 31.03.2010], vol. 132, nº 3, página.

48. 493. 1-18 X S. URREGO et al., "Bottle-around-the-ship: A method to encapsulate enzymes in ordered mesoporous materials", Microporous and Mesoporous Materials, 2010 [accesible en línea 29.09.2009], vol. 129, nº 1-2, página.

17. 178. 1-18 A WO 2009010561 A1 (NOVOZYMES) 22.01.2009, todo el documento. 1-20 A R. M. BLANCO et al., "Functionalization of mesoporous silica for lipase immobilization. Characterization of the support and the catalyst", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2004, vol. 30, nº 2, página.

8. 93. 1-20 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 02.03.2012 Examinador E. Davila Muro Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201030515

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N, B01J Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, XPESP, CAPLUS, BIOSIS, MEDLINE

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201030515

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 02.03.2012

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201030515

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

16. 168 D02 E. SERRA et al., Micropor. Mesopor. Mat., 2010, vol. 132, nº 3, pgs.

48. 493 D03 S. URREGO et al., Micropor. Mesopor. Mat., 2010, vol. 129, nº 1-2, pgs.173-178

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La invención se refiere a unos biocatalizadores híbridos formados por un soporte de organosílices mesoporosas periódicas (PMO) y lipasas inmovilizadas sobre dicho soporte en una cantidad superior a 5 mg/g de material mesoporoso. La invención también se refiere a la preparación de los biocatalizadores híbridos y uso de los mismos en procesos de condensación para la obtención de compuestos con utilidad en distintas áreas industriales.

El documento D01 divulga unos biocatalizadores que comprenden una lipasa obtenida a partir de Rhizopus or y zae (ROL) que es inmovilizada sobre un soporte de sílice pura SBA-15 o una organosílice PMO con puentes etileno (ver páginas 165166) , en una proporción de 61, 8 y 65, 2 mg de lipasa por g de soporte SBA-15 o PMO respectivamente (ver página 167, Tabla 2) . Estos catalizadores se utilizan en una reacción de transesterificación de (S) -glicidol y vinil n-butirato (ver página 166, Esquema 1) . En el caso del soporte de PMO, éste se prepara a partir de precursores bisalcoxisililados (R1O) 3Si-RSi (OR1) 3 como tetraetilortosilicato (TEOS) y 1, 2-bis (trimetoxisilil) etano (BTMSE) , y el surfactante pluronic P123; a continuación se elimina el surfactante y se adiciona una solución tamponanda de lipasa ROL.

El documento D02 divulga biocatalizadores formados por una lipasa obtenida a partir de Candida antárctica fracción B (CaLB) inmovilizada sobre distintos soportes de sílices mesoporosas, en concreto, sílice amoría Oct-AS-Me y Oct-AS-Et funcionalizada con octiltrimetoxisilano y octiltrietoxisilano respectívamente, sílices SBA-15 y Me-SBA-15, y organosílice mesoporosa PMO con puentes etileno (ver página.

48. 489 y Tabla 1) . La cantidad máxima de lipasa inmovilizada sobre estos soportes es d.

2. 200 mg/g de soporte, siendo 91 mg/g en el caso de PMO. En D02 se estudia la actividad hidrolítica de estos catalizadores sobre tributirina (ver página 488) .

El documento D03 divulga el procedimiento de obtención de materiales organosílices mesoporosos ordenados en los que se inmoviliza una lipasa de tipo CaLB. Se preparan biocatalizadores con una carga enzimática d.

2. 90 mg de lipasa por g de soporte mesoporoso (ver página 178, Tabla 3) . En este caso también se divulga la utilización de estos catalizadores heterogéneos en la hidrólisis de tributirina.

En consecuencia, el objeto de la invención recogido en las reivindicaciones 1-18 ya es conocido a la vista de los documentos D01-D03. Por lo tanto, esas reivindicaciones no se considera nuevas ni con actividad inventiva según los artículos 6.1 y 8.1 LP 11/1986.

Respecto a las reivindicaciones 19 y 20, relativas al uso de estos biocatalizadores heterogéneos en reacciones de condensación de ácidos grasos y alcoholes para obtener biodiesel, queda divulgado en D01 la utilización de catalizadores de lipasas inmovilizadas sobre soportes PMO en reacciones de transesterificación de alcoholes (glicidol) y ésteres (vinil butirato) , y por tanto se considera que no implica actividad inventiva el hecho de utilizar ácidos grasos o sus ésteres. En consecuencia, las reivindicaciones 19-20 se considera que carecen de actividad inventiva según el artículo 8.1 LP 11/1986.

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