Aumento de la expresión de inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgénicos no humanos.

Un animal transgénico no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos,

roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que comprende: (a) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la lgα; humana de Id. de Sec. Nº : 1 y/o, (b) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igβ humana de Id. de Sec. Nº : 7, y, (c) una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana; en la que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de células B humanas.

Aumento de la expresión de inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgénicos no humanos

Campo de la invención Esta invención está relacionada con un método para mejorar la expresión de inmunoglobulina humana en animales transgénicos no humanos mediante la promoción del desarrollo de células B normales y mediante el sostenimiento de la expresión de anticuerpos humanos en animales no humanos portadores del loci de inmunoglobulina humana. En particular, esta invención está relacionada con la expresión simultánea de transgenes que codifican Igα Oy/o Igβ humana, componentes del receptor de linfocito B, y transgenes que codifican un locus o loci de inmunoglobulina humana. Este método permite la expresión dominante de anticuerpos humanos, por ejemplo en la sangre, leche o huevos de los animales transgénicos no humanos.

Descripción de la materia relacionada Los anticuerpos son una clase importante de productos farmacéuticos que se han utilizado con éxito en el tratamiento de varias enfermedades y condiciones humanas, como el cáncer, enfermedades alérgicas, prevención del rechazo de un transplante y enfermedad de huésped frente a injerto.

El principal problema de las preparaciones de anticuerpo obtenidas a partir de animales no humanos es la inmunogenicidad intrínseca de las inmunoglobulinas no humanas en pacientes humanos. Para poder reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos, se ha demostrado que al fusionar exones de la región variable (V) de animales con exones de la región constante (C) humana, se puede obtener un gen de anticuerpo quimérico. Dichos anticuerpos quiméricos o humanizados presentan una mínima inmunogenicidad en humanos y son apropiados para utilizar en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.

Se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanizados y se utilizan en la práctica clínica. No obstante, el uso de anticuerpos monoclonales en general, ya sean quimericos, humanizados o humanos, para el tratamiento de enfermedades devastadoras como el cáncer o infecciones con patógenos virulentos, está limitado debido a la complejidad, etiología multifactorial y adaptabilidad de estas enfermedades. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra dianas únicas normalmente fracasan cuando estas dianas cambian, evolucionan y mutan. Por ejemplo, las neoplasias pueden ganar resistencia a las terapias con anticuerpos monoclonales estándar. Una solución a este problema es utilizar anticuerpos policlonales que poseen la capacidad de dirigirse hacia una serie de dianas en evolución. Los anticuerpos policlonales pueden neutralizar toxinas bacterianas o virales, y dirigir respuestas inmunitarias para matar y eliminar a los patógenos.

De acuerdo con esto, existe una gran necesidad clínica de métodos adecuados para la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales y policlonales de gran titulación, alta afinidad, humanizados. Además, debido a que la producción de anticuerpos en animales transgenicos más grandes como conejos, pollos, ovejas y vacas está favorecido desde un punto de vista de rendimiento del anticuerpo, la creación de animales fundadores más grandes que expresan mayores cantidades de productos codificados por transgenes también es muy deseable.

Los anticuerpos monoclonales humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR, y posiblemente algunos residuos FR, están sustituidos por residuos de sitios análogos en animales no humanos, p.ej., anticuerpos de roedores. La humanización puede realizarse en esencia siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988) ) , mediante la sustitución de CDR de animales no humanos o secuencias de CDR (p.ej., roedores) , por las correspondientes secuencias de un anticuerpo monoclonal humano.

Mientras se realizaban anticuerpos humanizados en animales, se encontró un problema que es la producción endógena de anticuerpos del huésped sobre el anticuerpo transgénico, que necesita ser suprimido. Se ha descrito que la deleción homocigota del anticuerpo, gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal, resulta en la inhibición completa de la producción endógena del anticuerpo. La transferencia de un conjunto de genes de inmunoglobulina humana de línea germinal en dicho ratón mutante de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras la presentación de antígenos. Véase, p.ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993) ; Bruggemann et al., Year in Inmunol., 7: 33 (1993) ; Nº de Patente Estadounidense 7.064.244 depositada el 20 de junio de 2006.

La introducción de genes de inmunoglobulina humana en el genoma de ratones resulta en la expresión de un repertorio diversificado de anticuerpos humanos en estos ratones modificados genéticamente. La generación de ratones que expresan anticuerpos quiméricos humano-ratón se han descrito en Pluschke et al., Journal of Inmunological Methods 215: 27-37 (1998) . La generación de ratones que expresan polipéptidos de inmunoglobulina humana se han descrito en Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989) ; Lonberg et al., Int. Rev. Inmunol. 13 (1) :65-93 (1995) ; y Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8 (4) : 455-8 (1997) ; Patente Estadounidense Nº 5.545.806,

depositada en Agosto de 1996; Patente Estadounidense Nº 5.545.807, depositada en Agosto de 1996 y Patente Estadounidense Nº 5.569.825, depositada en Octubre de 1996. La generación de vacas que expresan anticuerpos humanos se ha descrito en Kuroiwa et al., Nature Biotech 20 (9) : 889-894 (2002) . La producción de animales transgénicos no humanos que expresan transloci de inmunoglobulina humana o humanizada y la producción de anticuerpos de dichos animales transgénicos también se ha descrito en detalle en la Publicación PCT Nº WO 92/03918, WO 02/12437, y en las Patentes Estadounidenses Nº 5.814.318, y 5.570.429.

Los anticuerpos humanizados obtenidos presentan una mínima inmunogenicidad en humanos y son apropiados para su uso en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.

Mientras que las aproximaciones en ingeniería genética citadas anteriormente resulta en la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina humana en ratones modificados genéticamente, el nivel de expresión de inmunoglobulina humana es inferior al normal. Esto puede ser debido a elementos regulatorios específico de especie en el loci de inmunoglobulina que son necesarios para una expresión eficiente de inmunoglobulinas. Tal como se ha demostrado en líneas celulares transfectadas, los elementos regulatorios presentes en los genes de inmunoglobulina humana puede que no funcionen de forma adecuada en animales no humanos. Se han descrito muchos elementos reguladores en genes de inmunoglobulina. Son de particular importancia los potenciadores (3') de las regiones constantes de cadena pesada y los potenciadores intrónicos en los genes de cadena ligera. Además, otros elementos de control, aún por identificar, pueden estar presentes en los genes de inmunoglobulina. Estudios en ratones han demostrado que la cola de membrana y la cola citoplasmática de la forma de membrana de las moléculas de inmunoglobulina juegan un papel importante en los niveles de expresión de anticuerpos quiméricos humano-ratón en el suero de ratones homocigotos para el gen humano Cγl. Por lo tanto, para la expresión de genes de inmunoglobulina heterólogos en animales, es deseable sustituir secuencias que contienen elementos potenciadores y exones que codifican la cola transmembranal (exón M1) y la cola citoplasmática (exón M2) con secuencias que se encuentran normalmente en el animal en posiciones similares.

La expresión de la inmunoglobulina humana en estos animales genéticamente modificados puede también verse afectada por el desarrollo de células B de las células B humanos portadores de loci de inmunoglobulina humana o humanizada. La influencia del receptor de células B (BCR) sobre el desarrollo de células B se ha estudiado de forma extensa en ratones. No obstante, no está claro cómo un anticuerpo humano o parcialmente humano se combina para formar un BCR funcional, y cómo dicho BCR influirá de forma eficiente el desarrollo y supervivencia de células B no humanos que expresan Ig humano o humanizado, en animales transgénicos, que a su vez, afectarán a las proporciones de anticuerpo.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra... [Seguir leyendo]

1. Un animal transgénico no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que comprende:

(a) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº : 1 y/o, (b) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igβ humana de Id. de Sec. Nº : 7, y, (c) una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana; en la que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de células B humanas.

10 2. El animal transgénico no humano de la reivindicación 1 en el que la expresión de cualquier Ig endógena y/o subunidades de la Igα y/o IgÃ? del animal transgénico no humano se han reducido sustancialmente.

3. El animal transgénico no humano de la reivindicación 1 o 2 que es un conejo.

15 4. Las células B aisladas de dicho animal transgénico no humano de la reivindicación 1, en las que dichas células B expresan la subunidad nativa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº : I y/o la subunidad nativa de la IgÃ? humana de Id. de Sec. Nº : 7, y un locus de inmunoglobulina humana.

5. Las células B aisladas de la reivindicación 4 en las que dichas células B están inmortalizadas.

6. Las células B aisladas de la reivindicación 4 o 5 en las que dichas células B se han derivado de un conejo.

7. Un método para obtener anticuerpos humanos en un animal no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos,

pavos, patos y gansos que comprende: (a) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº : 1, y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la IgÃ? humana de Id. de Sec. Nº : 7 en dicho animal no humano y, (b) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica un locus de una inmunoglobulina humana en dicho animal no humano;

(c) someter a dicho animal a un estímulo antigénico; y (d) el aislamiento de anticuerpos humanos a partir de dicho 30 animal.

8. El método para producir los anticuerpos humanos de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

35 9. Un método para producir un animal no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que expresan anticuerpos humanos o humanizados que comprenden: (a) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igα human de Id. de Sec. Nº : 1 y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la IgÃ? humana de Id. de Sec. Nº : 7 en las células B de dicho animal no

humano; y, (b) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica un locus de una inmunoglobulina humana en dicho animal no humano; en el que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de las células B humanas.

10. El método de la reivindicación 9 en el que dicho animal crea una diversidad de anticuerpos por conversión 45 génica y/o hipermutación somática.

11. El método de la reivindicación 10 en el que dicho animal es un conejo.

M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)

M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)

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(Id. De Sec. Nº 7) (Id. De Sec. Nº 8) (Id. De Sec. Nº 9) Figura 2: 1g beta (Id. De Sec. Nº 10) (Id. De Sec. Nº 11) (Id. De Sec. Nº 12)