Anticuerpos monoclonales, anticuerpos que reaccionan de forma cruzada y procedimiento para la fabricación de los mismos.

Anticuerpo que reacciona de forma cruzada con dos o más receptores Apo-2L diferentes.

Anticuerpos monoclonales, anticuerpos que reaccionan de forma cruzada y procedimiento para la fabricación de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a un procedimiento para fabricar anticuerpos monoclonales. La presente invención también se refiere a anticuerpos obtenibles mediante el procedimiento que específicamente reacciona de forma cruzada con dos o más receptores diferentes a los que se puede unir el ligando Apo-2 (Apo2L) .

Descripción de la técnica anterior

Los anticuerpos nativos son sintetizados principalmente por linfocitos especializados llamados “células plasmáticas”. La producción de una fuerte respuesta de los anticuerpos en un animal huésped está controlada por la inducción y regulación de la diferenciación de células B en estas células plasmáticas. Esta diferenciación implica que células B vírgenes (que tienen un anticuerpo modificado como receptor de antígeno de la superficie celular y no secretan anticuerpos) se conviertan en células B activadas (ambas secretan anticuerpos y tiene anticuerpos en la superficie celular) , y entonces en células plasmáticas (que son fábricas de anticuerpos altamente especializadas sin receptores de antígeno en la superficie) . Este proceso de diferenciación está influenciado por la presencia de antígeno y por la comunicación celular entre células B y células T auxiliares.

Debido a su capacidad para unirse selectivamente a un antígeno de interés, se han utilizado ampliamente anticuerpos para investigación, aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Los usos potenciales para los anticuerpos se expandieron con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales. A diferencia del antisuero policlonal, que incluye una mezcla de anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, los anticuerpos monoclonales están dirigidos contra un único determinante o epítopo en el antígeno y son homogéneos. Además, los anticuerpos monoclonales se pueden producir en cantidades ilimitadas.

El trabajo seminal por Kohler y Milstein describió el primer procedimiento para obtener hibridomas que pueden producir anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein Nature 256:495 (1975) ) . En este procedimiento, se fusiona una célula inmune secretora de anticuerpos, aislada de un ratón inmunizado, con una célula de mieloma, un tipo de tumor de células B. Las células híbridas (es decir, hibridomas) resultantes se pueden mantener in vitro y pueden continuar secretando anticuerpos con una especificidad definida.

Dado que los anticuerpos monoclonales murinos derivan de ratones, su uso como agentes terapéuticos en humanos está limitado debido a la respuesta anti-ratón humana que tiene lugar tras la administración del anticuerpo murino a un paciente. Por consiguiente, los investigadores han diseñado anticuerpos no humanos para hacerlos parecer más humanos. Dichos anticuerpos diseñados se denominan anticuerpos “quiméricos”; en los que un dominio de unión a antígeno no humano se acopla a un dominio constante humano (Cabilly et al., Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) . El isotipo del dominio constante humano se puede seleccionar para ajustar a medida el anticuerpo quimérico para la participación en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento. En un esfuerzo adicional por resolver las funciones de unión a antígeno de los anticuerpos y minimizar el uso de secuencias heterólogas en anticuerpos humanos, Winter y colaboradores [ (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature 332:323327 (1988) ; Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) ] han sustituido residuos de la región determinante de complementariedad (CDR) del roedor por los segmentos correspondientes de un anticuerpo humano para generar anticuerpos humanizados.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término anticuerpo “humanizado” es una realización de anticuerpos quiméricos en la que sustancialmente menos de un dominio variables humano intacto ha sido sustituido por las correspondientes secuencias de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que los residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de la región armazón (“framework”) son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Otros grupos han desarrollado procedimientos para fabricar anticuerpos monoclonales completamente “humanos”. Dichos anticuerpos se pueden generar inmortalizando una célula humana que secreta un anticuerpo específico utilizando un virus Epstein-Barr (EBV) [Steinitz at. al. Nature 269:420-422 (1977) ]; o preparando un hibridoma humano-humano que secreta el anticuerpo monoclonal [Olsson et al. PNAS (USA) 77:5429-5431 (1980) ]. Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bibliotecas de expresión en fagos. [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992) ; Vaughan et al. Nature Biotech

14:309 (1996) ].

Alternativamente, también se han fabricado anticuerpos humanos en animales de laboratorio transgénicos, en los que los se han introducido loci de inmunoglobulina humana en el animal y los genes de inmunoglobulina endógena se inactivan parcial o totalmente [Fishwild ec al. Nature Biotech. 14:845-851 (1996) ; y Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) ].

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un anticuerpo que específicamente reacciona de forma cruzada con dos o más receptores Apo-2L diferentes; por ejemplo, que se une específicamente al polipéptido Apo-2 y además específicamente reacciona de forma cruzada con otro receptor Apo-2L, tal como se define en las reivindicaciones.

La presente solicitud proporciona además un anticuerpo monoclonal que tiene las características biológicas de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3H1.18.10, 3H3.14.5 y 3D5.1.10.

Además, la presente invención proporciona líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales descritos en la presente invención tal como se definen en las reivindicaciones.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados que comprenden ADN que codifica un anticuerpo de la presente invención; un vector que comprende el ácido nucleico; una célula huésped que comprende el vector; un procedimiento de producción de un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped en condiciones en las que el ADN se expresa y, opcionalmente, que comprende además recuperar el anticuerpo del cultivo de células huésped.

La presente invención proporciona además composiciones que comprenden un anticuerpo de la invención y un portador.

Además, se describe un procedimiento de inducción de apoptosis en células de cáncer de mamífero que comprende exponer las células de cáncer de mamífero a una cantidad eficaz de un anticuerpo agonístico antireceptor Apo-2L que reacciona de forma cruzada, tal como se describe en la presente invención.

También se describe un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en dicho recipiente, donde la composición incluye un anticuerpo tal como se describe aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa un esquema de ejemplo de inmunización de antígeno mixto para los inmunógenos: Apo-2-IgG, DR4-IgG, DcR1-IgG y DcR2-IgG. La figura 2 ilustra esquemas de inmunización de antígeno único para los antígenos: Apo-2-IgG, DR4-IgG y DcR2-IgG. La figura 3 muestra títulos de suero específicos de antígenos de ratones inmunizados con DR4-IgG, Apo-2-IgG o DcR2-IgG individualmente. Se recogió el suero de ratones Balb/c (5 ratos/grupo) que se inmunizaron 10 veces en la planta de la pata (F.P.) con 1 !g de cada molécula de inmunoadhesina en MPL-TDM. La actividad hacia la parte Fc de IgG humana se preadsorbió mediante la incubación de 100 ml de suero (dilución 1:500 en PBS) con 3 mg por 50 ml de CD4-IgG durante 1 h a temperatura ambiente (RT) . A continuación, se prepararon diluciones en serie de este suero preadsorbido en PBS. Las actividades específicas de antígeno de este suero preadsorbido se determinaron en un ELISA de captura utilizando pocillos de microtitulación recubiertos por antígenos específicos. La figura 4 muestra títulos de suero específico de antígeno de ratones inmunizados con DR4-IgG, Apo-2-IgG, DcR1-IgG y DcR2-IgG juntos. Los ratones se inmunizaron en la F.P. con una mezcla de DR4-IgG, Apo-2-IgG, DcR1-IgG y DcR2-IgG (los ratones se inmunizaron 14 veces; DcR2-IgG sólo se incluyó en la mezcla... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo que reacciona de forma cruzada con dos o más receptores Apo-2L diferentes.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que se une específicamente al polipéptido Apo-2 y además reacciona de forma cruzada con otro receptor Apo-2L.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1 que:

(i) es un fragmento de anticuerpo;

(ii) comprende residuos de una región hipervariable no humana y residuos de una región armazón humana; o

(iii) es un anticuerpo humano.

5. Anticuerpo que tiene las características biológicas de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3H1.18.10 (ATCC número HB-12535) y 3H3.14.5 (ATCC número HB-12534) .

6. Anticuerpo según la reivindicación 5, que (i) se une al mismo epítopo que el epítopo al que se une un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3H1.18.10 (ATCC número HB-12535) y 3H3.14.5 (ATCC número HB-12534) , o (ii) tiene los residuos de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3H1.18.10 (ATCC número HB-12535) y 3H3.14.5 (ATCC número HB12534) .

7. Línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en 3H1.18.10 (ATCC número HB-12535) y 3H3.14.5 (ATCC número HB-12534) .

8. Ácido nucleico aislado que comprende ADN que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. Procedimiento de producción de un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 en condiciones en las que se expresa el ADN y, opcionalmente, que comprende además recuperar el anticuerpo del cultivo de células huésped.

12. Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador farmacéuticamente aceptable.

DO 450/620

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% DE APOPTOSIS

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