Uso de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano aislado dirigido hacia un fragmento oxidado deapoliproteína B en la fabricación de una composición farmacéutica para tratamiento terapéutico o profilactico deaterosclerosis por medio de inmunización pasiva,

en el cual el fragmento oxidado es: IEIGLEGKGFEPTLEALFGK yen donde el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque comprende la secuencia de ácidonucleico de la región variable pesada (VH) y la secuencia de ácido nucleico de la región variable ligera (VL) de:SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4; o SEC ID Nº:23 y SEC ID Nº:24; o SEC ID Nº:27 y SEC ID Nº:28.

Campo Técnico

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, humanos aislados como se define en las reivindicaciones promovidos contra un péptido que es un fragmento oxidado de apoliproteína B el cual es IEIGLEGKGFEPTLEALFGK, en anticuerpos partículares que van a ser usados para terapia de inmunización para tratamiento de la aterosclerosis, y el método para su preparación.

También se describe aquí pero no se reivindica explícitamente:

El uso de cualquier anticuerpo aislado promovido contra una forma oxidada del péptido p45 listado en la tabla 1, en partícular un péptido MDA modificado, preferiblemente junto con un portador y adyuvante adecuado como una inmunoterapia o "vacuna antiaterosclerosis" para la prevención y tratamiento de trastorno cardiovascular isquémico..

Antecedentes de la invención

Se sabe que los efectos protectores de inmunidad humoral son mediados por una familia de glicoproteínas relacionadas estructuralmente llamadas anticuerpos. Los anticuerpos inician su actividad biológica ligándose a antígenos. La unión de anticuerpos a antígenos es generalmente específica a un antígeno y la unión es normalmente de alta afinidad. Los anticuerpos son producidos por linfocitos B. La sangre contiene mucho anticuerpos diferentes, cada uno derivado de un clon de células B y cada uno teniendo una estructura y especificidad para el antígeno distinta. Los anticuerpos están presentes en la superficie de linfocitos B, en el plasma, en el fluido intersticial de los tejidos y en fluidos secretados tales como saliva y moco en las superficies mucosales.

Todos los anticuerpos son similares en su estructura general, teniendo en cuenta ciertas similaridades en características fisicoquímicas tales como carga y solubilidad. Todos los anticuerpos tienen una estructura nuclear común de dos cadenas ligeras idénticas, cada una casi de 24 kilo Daltons, y dos cadenas idénticas pesadas de casi 55-70 kilo Daltons cada una. Una cadena ligera se une a cada cadena pesada, y las dos cadenas pesadas están unidas entre sí. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas contienen una serie de unidades homólogas repetitivas, cada una de casi 110 residuos de aminoácidos de longitud que se doblan FOLD independientemente en un motivo común globular, llamado dominio de inmunoglobulina (Ig) . La región de un anticuerpo formado por la asociación de las dos cadenas pesadas es hidrofóbica. Se conoce que los anticuerpos, y especialmente los anticuerpos monoclonales se insertan en el sitio donde la cadena ligera se une a la cadena pesada cuando están sometidas a condiciones físicas o químicas adversas. A causa de que los anticuerpos contienen numerosos residuos de cisteína, tienen muchos uniones cisteína - disulfuro de cisteína. Todos los dominios Ig contienen dos capas de láminas plegadas-beta con tres o cuatro cepas de cadenas polipéptidas antiparalelas.

A pesar de su total similitud, las moléculas de anticuerpos pueden dividirse en un pequeño número de clases y subclases distintas en base a características fisicoquímicas tales como tamaño, carga y solubilidad, y a su comportamiento en la unión con antígenos. En los humanos, las clases de moléculas anticuerpo son: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Miembros de cada clase se dice que son del mismo isotipo. Los isotipos IgA y IgG se dividen además en subtipos llamados IgA1, IgA2 and IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Las cadenas pesadas de todos los anticuerpos en un isotipo comparten regiones extensas de identidad de secuencia aminoácida, pero difieren en los anticuerpos que pertenecen a otros isotipos o subtipos. Las cadenas pesadas son designadas por las letras del alfabeto griego correspondientes al isotipo general del anticuerpo, por ejemplo, cadenas pesadas IgA contienen .alpha., IgD contienen .delta., IgE contienen .epsilon., IgG contienen .gamma., y IgM contienen .mu.. IgG, IgE y IgD circulan como monómeros, mientras que las formas segregadas de IgA y IgM son dímeros o pentámeros, respectivamente, estabilizados por la cadena J. Algunas moléculas IgA existen como monómeros o trímeros.

Hay entre 108 y 1010 moléculas de anticuerpo estructuralmente diferentes en cada individuo, cada una con una única secuencia aminoácida en su sitios combinatorios de antígeno. La diversidad secuencial en anticuerpos se encuentra predominantemente en tres cortas extensiones en los dominios aminoterminales de las cadenas pesadas y ligeras llamados regiones (V) , para distinguirlas de las regiones (C) constantes más conservadas.

La aterosclerosis es una patología crónica que causa un engrosamiento de la capa más interna (la íntima) de arterias de tamaño grande y medio. Disminuye el flujo sanguíneo y puede causar isquemia y destrucción del tejido en órganos alimentados por el vaso afectado. La aterosclerosis es la causa principal de cardiopatía vascular incluyendo el infarto de miocardio, derrame cerebral y arteriopatía periférica. Es la principal causa de muerte en el mundo occidental y se predice que se convertirá en la iniciadora causa de muerte en todo el mundo en dos décadas.

La patología se inicia por acumulación de lipoproteínas, fundamentalmente la lipoproteína de baja densidad (LDL) , en la matriz extracelular del vaso. Estas partículas LDL se agregan y se someten a modificación oxidativa. El LDL oxidado es tóxico y causa daño vascular. La aterosclerosis representa en muchos aspectos una respuesta a este daño que incluye inflamación y fibrosis.

En 1989 Palinski y colaboradores identificaron autoanticuerpos circulantes contra el LDL oxidado en humanos. Esta observación sugirió que la aterosclerosis puede ser una patología inmune causada por reacciones inmunes contra lipoproteínas oxidadas. En este momento los laboratorios comenzaron a buscar asociaciones entre títulos de anticuerpo contra el LDL oxidado y cardiopatía vascular. Sin embargo, el cuadro que surgió de estos

estudios dista de estar claro. Existían anticuerpos contra un gran número de diferentes epítopos en LDL oxidado, pero la estructura de estos epítopos fue desconocida. El término “anticuerpos de LDL oxidado" de este modo se refería a una mezcla desconocida de diferentes anticuerpos más que a un anticuerpo específico. Los anticuerpos IgM independientes de las células T fueron más frecuentes que los anticuerpos IgG dependientes de las células T.

Los anticuerpos contra LDL oxidado estaban presentes tanto en pacientes con cardiopatía vascular como en controles sanitarios. Sin embargo algunos iniciadoros estudios informaron sobre asociaciones entre títulos de anticuerpos de LDl oxidado y cardiopatía vascular, otros fueron incapaces de encontrar tales asociaciones. Una debilidad principal de estos estudios fue que las pruebas ELISA usadas para determinar títulos de anticuerpo emplearon partículas de LDL oxidado como ligando. La composición de LDL es diferente en diferentes individuos, el grado de modificación oxidativa es difícil tanto para controlar como para evaluar y los niveles de anticuerpos contra los diferentes epítopos en las partículas de LDL oxidado no pueden ser determinados. Hasta cierto punto, debido a los problemas técnicos ha sido difícil evaluar el papel de las respuestas de los anticuerpos contra el LDL oxidado usando técnicas disponibles hasta ahora, pero sin embargo, no es posible crear componentes bien definidos y reproducibles de una vacuna si uno usa partículas intactas de LDL oxidado.

Otro manera de investigar la posibilidad de que reacciones autoinmunes contra LDL oxidado en la pared vascular juegue un papel clave en el desarrollo de aterosclerosis es inmunizar animales contra su propio LDL oxidado. La idea detrás de este enfoque es que si las reacciones autoinmunes contra LDL oxidado son reforzadas usando técnicas clásicas de inmunización esto resultaría en inflamación vascular incrementada y progresión de la aterosclerosis. Para probar esta hipótesis fueron inmunizados conejos con LDL oxidado homólogo y luego se indujo aterosclerosis alimentando a los animales con una dieta alta en colesterol durante 3 meses.

Sin embargo, en contraste con la hipótesis original la inmunización con LDL oxidado tenia un efecto de protección reduciendo la aterosclerosis en alrededor del 50%. Resultados parecidos fueron también obtenidos en un estudio posterior en el cual la dieta alta en colesterol fue combinada con daño con vascular balón para producir un desarrollo más agresivo de la placa. En paralelo con nuestros estudios otros varios... [Seguir leyendo]

1. Uso de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano aislado dirigido hacia un fragmento oxidado de apoliproteína B en la fabricación de una composición farmacéutica para tratamiento terapéutico o profilactico de aterosclerosis por medio de inmunización pasiva, en el cual el fragmento oxidado es: IEIGLEGKGFEPTLEALFGK y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la región variable pesada (VH) y la secuencia de ácido nucleico de la región variable ligera (VL) de:

SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4; o SEC ID Nº:23 y SEC ID Nº:24; o SEC ID Nº:27 y SEC ID Nº:28.

2. Uso de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde el fragmento oxidado ha sido oxidado usando malondialdehido.

3. Uso de acuerdo a las Reivindicaciones 1-2, en donde el fragmento oxidado ha sido oxidado usando cobre.

4. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo dirigido hacia un fragmento oxidado de apoliproteína B, en el cual el fragmento oxidado es: IEIGLEGKGFEPTLEALFGK, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la región variable pesada (VH) y la secuencia de ácido nucleico de la región variable ligera (VL) de: SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4; o SEC ID Nº:23 y SEC ID Nº:24; o SEC ID Nº:27 y SEC ID Nº:28.

5. Método para la preparación de un anticuerpo aislado como se define en la Reivindicación 4, usando una biblioteca de fragmentos para generar fragmentos específicos de anticuerpo humano contra el fragmento oxidado de apoliproteína B como se define en la Reivindicación 1, con lo cual fragmentos identificados de anticuerpo que tienen las características deseadas son recontruidos en inmunoglobulinas humanas de longitud completa para ser usados para fines terapéuticos.

6. Método para amplificación de un anticuerpo humano aislado como se define en la Reivindicación 4, usando una tecnología recombinante, comprendiendo la transferencia de genes codificando las partes variables de scFv seleccionado a vectores IgG1 humanos de longitud completa usando una amplificación PCR en donde los iniciadores usados son:

iniciadores para amplificación de segmentos VH:

5’VH: 5’-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG (SEC. ID. Nº. 13)

3’VH: 5’-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG (SEC. ID. Nº. 14)

e iniciadores para amplificación de segmentos VL:

5’VL: 5’-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG (SEC. ID. Nº. 15)

3’VL: 5’-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT (SEC. ID. Nº. 16) .

7. Método según la Reivindicación 6 en donde las colonias conteniendo plásmidos de regiones de cadena pesada y de regiones de cadena ligera con insertos de región de variable pesada y de cadena de variable ligera son identificados por PCR de colonia usando

Iniciador hacia delante: 5’-ATGGGTGACAATGACATC (SEC. ID. Nº. 17)

Iniciador reverso 5’-AAGCTTGCTAGCGTACG (SEC. ID. Nº. 18) .

8. Composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo como se define en la Reivindicación 4 para tratamiento terapéutico o profilactico de aterosclerosis por medio de inmunización pasiva, cuyo anticuerpo o fragmento de anticuerpo está presente en combinación con un excipiente farmacéutico.

9. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo dirigido hacia un fragmento oxidado de apoliproteína B, en el cual el fragmento oxidado es: IEIGLEGKGFEPTLEALFGK, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la región variable pesada (VH) y la secuencia de ácido nucleico de la región variable ligera (VL) de: SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4; o SEC ID Nº:23 y SEC ID Nº:24; o SEC ID Nº:27 y SEC ID Nº:28

para uso en medicina.

10. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo dirigido hacia un fragmento oxidado de apoliproteína B, en el cual el fragmento oxidado es: IEIGLEGKGFEPTLEALFGK, y en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la región variable pesada (VH) y la secuencia de ácido nucleico de la región variable ligera (VL) de: SEC ID Nº:3 y SEC ID Nº:4; o SEC ID Nº:23 y SEC ID Nº:24; o SEC ID Nº:27 y SEC ID Nº:28.

para el tratamiento terapéutico o profiláctico de aterosclerosis por medio de inmunización pasiva.