Anticuerpo monoclonal que se une a Met en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina y métodos relacionados.

Anticuerpo monoclonal anti-Met producido por la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de registro PTA-7680,

o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.

Anticuerpo monoclonal que se une a Met en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina y métodos relacionados 5

Campo de la invención La presente invención se encuentra en el campo del diagnóstico molecular y en el de la medicina.

Antecedentes de la invención La quinasa receptora c-Met regula la proloferación, migración, diferenciación y morfogénesis de ramificación celular durante el desarrollo y la homeostasis1-3. Met también se expresa en la superficie celular de una variedad de tumores sólidos humanos primarios y en sus metástasis (http://www.vai.org/meet/) . La secuencia de aminoácidos del 15 dominio extracelular de Met humano se proporciona en la SEC ID Nº: 1, aminoácidos 25-567. En su estado activado, el receptor Met controla el crecimiento, la invasión y la metástasis de las células cancerosas a través de múltiples vías de transducción de señales4. En algunas líneas celulares de cáncer, la pérdida de la expresión de Met a través del silenciamiento promueve la apoptosis, lo que demuestra que Met es necesario para la supervivencia5-7 . La actividad de Met aumenta a través de mutaciones en los dominios quinasa o yuxtamembrana8-11, a través de la sobreexpresión12, 13, o a través de la unión a su ligando, el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF/SF) 14, 15. La activación de la mutación de Met en la línea germinal, que estimula la activación de Met independiente de ligando, es la causa del desarrollo de carcinomas papilares renales hereditarios10. En las células cancerosas, la amplificación selectiva del alelo mutado de Met, mejora adicionalmente la actividad global de la Met quinasa16. La magnitud de expresión de Met predice la agresividad de una serie de tipos de cáncer (http://www.vai.org/met/) . La detección y cuantificación precisas de la expresión de la proteína Met son necesarias para identificar los cánceres que probablemente son sensibles a los inhibidores de Met y el desarrollo de tales ensayos diagnósticos moleculares queda muy por detrás del desarrollo de fármacos.

Se ha asociado el alto nivel de expresión de c-Met con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer, que incluyen el de mama, de estómago, de cuello uterino, hepatocelular y de cabeza y cuello17-22. Aproximadamente el 25% de los cánceres de ovario y el 11% de los gliomas expresan niveles altos de c-Met. En el cáncer de mama, se observó la expresión de c-Met en un subgrupo de cánceres independientes de HER2, pero se asocia con la proliferación celular aumentada23, 24. En el cáncer de mama ductal, la expresión simultánea de Syndecan-1, E-cadherina y c-Met aumenta la angiogénesis y la linfangiogénesis25. Cualquier enfermedad asociada con la expresión de c-Met se denomina en el presente documento "enfermedad relacionada con Met". Sin embargo, se ha cuestionado la fiabilidad de los estudios inmunohistoquímicos a la luz de la variabilidad entre lotes del antisuero generado frente al péptido C-terminal en el receptor c-Met, que se ha utilizado en la mayoría de los estudios26. La mayoría de los anticuerpos Met disponibles en el mercado no son fiables (o no han sido sometidos a ensayo rigurosamente para verificar su fiabilidad) . Además del aumento de la expresión de c-Met, las concentraciones elevadas de HGF/SF en el microambiente tumoral también se han asociado con resultados adversos. Por ejemplo las células estromales tumorales hipóxicas en el cáncer de páncreas aumentan la secreción de HGF y aceleran la progresión del cáncer de páncreas27.

Las líneas celulares mesenquimales con expresión de c-Met y HGF modificada por ingeniería genética son altamente metastásicas y la expresión del receptor c-Met mutante o la amplificación del locus c-Met en las líneas 45 celulares aumenta el fenotipo proliferativo, invasivo y metástasico de los cánceres 6, 28-30. Junto con Myc, el c-Met de tipo silvestre provoca la carcinogénesis mamaria31. El c-Met es uno de los receptores tirosina quinasa (RTK) más frecuentemente desregulado o modificado genéticamente en los cánceres humanos avanzados y por lo tanto representa una diana de tratamiento atractiva. Se observan mutaciones de c-Met activadoras de la quinasa en los carcinomas esporádicos renal, de pulmón, de cabeza y cuello, hepatocelular, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) , cáncer gástrico y melanoma13, 32-35. Además, se ha detectado la amplificación del locus c-Met en el adenocarcinoma gástrico, colorrectal metastásico y esofágico12, 13, enfermedades relacionadas con Met adicionales. La activación de c-Met en las células cancerosas induce la secreción de factores angiogénicos, tales como VEGFA y IL-8 e inhibe la síntesis de trombospondina-1, un factor antiangiogénico36, 37. Además, la activación de c-Met en las células endoteliales provoca la angiogénesis. Aunque los efectos citotóxicos de la actividad inhibidora de Met sólo 55 pueden darse en los cánceres con c-Met activado, el efecto antiangiogénico puede existir con mayor frecuencia.

Se produjo un avance importante con el desarrollo de inhibidores de molécula pequeña de c-Met que son oralmente bioactivos ("agentes inhibidores de Met") . De estos inhibidores, PF-2341066 demuestra especificidad para la inhibición de c-Met y la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) y conduce a la regresión de los xenoinjertos de cáncer gástrico GTL-16 y los xenoinjertos de CPNM NCI-H441 a una dosis de 50 mg/kg/día38. A esta dosis, c-Met queda inhibido por completo y se logra la máxima eficacia del fármaco con larga duración. Los estudios preclínicos con anticuerpos anti-c-Met con un único brazo e inhibidores de la quinasa de molécula pequeña7, 39, 40, así como los estudios clínicos tempranos en pacientes destacan adicionalmente la promesa de los inhibidores de c-Met frente a una variedad de tipos de cáncer, sus propiedades farmacodinámicas favorables y su baja toxicidad. De esta manera, 65 cuando se utilizan para tratar los cánceres con un eje Met activo, estos fármacos pueden de hecho beneficiar a muchos pacientes de cáncer. Sin embargo, no se dispone de herramientas de diagnóstico molecular para identificar los tipos de cáncer que poseen vías Met activas.

Se necesitan con urgencia ensayos diagnósticos moleculares para detectar la expresión y determinar el estado de activación de las dianas de tratamiento de los inhibidores de la quinasa para mejorar el tratamiento de los pacientes 5 con cáncer. Los fármacos que se unen a receptores de la superficie celular, o que penetran en las células e inhiben las quinasas receptoras y no receptoras, muestran grandes promesas en la práctica clínica, sin embargo la detección de las dianas correspondientes en los cánceres humanos presenta un gran desafío. Además del ensayo Hercept para la medición cuantitativa de la expresión de Her-2/Neu, que requería un desarrollo largo y arduo para su uso en las muestras clínicas de rutina y la aprobación de la FDA, no se dispone de ensayos diagnósticos validados 10 para la expresión de la proteína quinasa receptora o no-receptora. La dificultad para desarrollar estos reactivos de diagnóstico se deriva del bajo nivel de expresión de las quinasas, el estado de activación lábil, que depende de la fosforilación de proteínas y la baja especificidad de los anticuerpos frente a la mayoría de los fosfoepítopos, que indican la actividad quinasa. Por consiguiente, la mayoría de las tirosina quinasas receptoras (RTK) carecen de los reactivos de detección para las mediciones de la expresión en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina 15 (FFPE) , que es la preparación de tejidos más comúnmente obtenida a partir de cánceres de pacientes. Resulta cada vez más evidente que la estratificación de pacientes para el tratamiento con inhibidores de la quinasa es crucial para el éxito con la actividad antineoplásica de este grupo de agentes. Para un tipo de tumor sólido dado, la frecuencia de los cánceres que expresan la proteína diana sensible al fármaco es pequeña. Por lo tanto, si los pacientes no se seleccionan cuidadosamente para el tratamiento, muchos agentes podían dejar de demostrar eficacia en la fase II y en la fase III de los ensayos clínicos.

El receptor c-Met es particularmente difícil de medir en tejidos FFPE, debido a la elección de reactivos pobres, la validación insuficiente del rendimiento de los anticuerpos c-Met en los tejidos FFPE y la sensibilidad de c-Met a la fijación en formalina. Teniendo en cuenta la promesa de agentes inhibidores de c-Met novedosos en la práctica clínica, se necesitan ensayos diagnósticos de acompañamiento para identificar a los pacientes que potencialmente se beneficiarían de estos agentes. Pozner-Moulis et al. (Laborator... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal anti-Met producido por la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de registro PTA-7680, o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo. 5

2. Anticuerpo anti-Met, o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo, que se une al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de registro PTA-7680, en el que el epítopo está dentro del polipéptido DVLPEFR en los residuos de aminoácido.

23. 242 de la proteína Met humana dentro de la secuencia SEC ID Nº: 1, o el epítopo está dentro del polipéptido DVLP en los residuos de aminoácido.

23. 239 de la SEC ID Nº: 1.

3. Anticuerpo anti-Met que se une a un polipéptido que consiste en los aminoácidos identificados en la SEC ID Nº 1

com.

23. 239, o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo. 15

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo se liga a un resto detectable.

5. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y opcionalmente un portador.

6. Kit, que comprende:

(a) un primer recipiente que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

(b) un segundo recipiente que comprende un portador, y

(c) las instrucciones para utilizar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para detectar Met, diagnosticar, pronosticar, o evaluar un agente inhibidor de Met; y, opcionalmente, uno o más de

(d) un segundo anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo; segundo anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno del mismo del primer recipiente, o

(e) un agente inhibidor de Met.

7. Método para detectar la presencia de Met en una muestra biológica, muestra de la que se sospecha que expresa Met, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de la que se sospecha que expresa Met obtenida de un paciente,

(b) proporcionar la composición de la reivindicación 5

(c) poner en contacto la muestra con la composición de la reivindicación 5, y

(d) detectar la presencia de Met en la muestra.

8. Método para diagnosticar o pronosticar una enfermedad relacionada con Met en un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene una enfermedad relacionada con Met, que comprende las etapas de: 45

(a) proporcionar la composición de la reivindicación 5,

(b) poner en contacto un tejido o una muestra biológica obtenida de dicho paciente con la composición de la reivindicación 5,

(c) determinar el nivel de expresión de Met en el tejido o en la muestra, y

(d) comparar el nivel de expresión con un control adecuado.

9. Método de la reivindicación 8 en el que la enfermedad relacionada con Met es el cáncer, tal como el cáncer de ovario.

55 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en el que el tejido o la muestra biológica se ha fijado en una solución de formaldehído.

11. Método para determinar la eficacia de un agente inhibidor de Met, que comprende las etapas:

(a) proporcionar un primer tejido o muestra biológica obtenida de un paciente que tiene un cáncer relacionado con Met antes del tratamiento con el agente inhibidor de Met;

(b) proporcionar la composición de la reivindicación 5;

(c) poner en contacto el primer tejido o muestra biológica y un tejido o muestra post-tratamiento, obtenida después de tratar al paciente con un agente inhibidor de Met, con la composición de la reivindicación 5;

65 (d) determinar el nivel de expresión de Met en cada uno del primer tejido o muestra biológica y el tejido o muestra post-tratamiento; y (e) comparar el nivel de expresión de Met del primer tejido o muestra biológica con el nivel de expresión de Met del tejido o muestra post-tratamiento para determinar la eficacia de dicho agente inhibidor de Met, en el que opcionalmente cada uno del primer tejido o muestra biológica y el tejido o muestra post-tratamiento se ha fijado en una solución de formaldehído.

12. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de la reivindicación 5 para su uso en un método de diagnóstico llevado a cabo en el cuerpo humano o de un animal.

13. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de la reivindicación 5 para su uso en 10 un método de diagnóstico de un trastorno relacionado con Met.

14. Línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection bajo el número de registro PTA-7680.