Procedimiento de agitación de una solución.

Procedimiento de agitación de una solución, que comprende poner en contacto una sustancia de enlace selectivo (1) inmovilizada sobre la superficie de un portador (3) con una solución contenida en un recipiente (4) que contiene un analito que reacciona con dicha sustancia de enlace selectivo (1),

y mezclar partículas finas (2) en la solución que contiene dicho analito, y mover dichas partículas finas (2) sin permitir el contacto de las mismas con la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo, caracterizado porque el portador (3) o el recipiente para la solución (4) tiene una estructura tal que las partículas finas (2) no se ponen en contacto con la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo y la anchura mínima de las partículas finas (2) es mayor que la distancia mínima entre la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo y el recipiente para la solución (4).

Procedimiento de agitación de una solución [SECTOR TÉCNICO]

La presente invención se refiere a un procedimiento de agitación de una solución que contiene un analito, en el que una sustancia de enlace selectivo inmovilizada sobre un portador se hace reaccionar con un analito, poniendo en contacto el portador sobre el que se ha inmovilizado, la sustancia que se enlaza selectivamente con el analito (denominada "sustancia de enlace selectivo" en la presente descripción) con una solución que contiene un analito. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de agitación de una solución que contiene un analito para acelerar la reacción entre una sustancia de enlace selectivo inmovilizada sobre un portador y dicho analito.

[TÉCNICA ANTERIOR]

Actualmente se están llevando a cabo investigaciones para analizar la información genética de diversos organismos. Se están determinando con una rapidez considerable un gran número de genes, incluidos los del ser humano, sus secuencias de bases, las proteínas codificadas por dichas secuencias génicas y las cadenas de glúcidos producidas secundariamente a partir de estas proteínas. Las funciones de los genes, proteínas y cadenas de glúcidos de secuencia conocida se pueden estudiar por diversos métodos. Los ácidos nucleicos y su relación con diversos genes y funciones biológicas se pueden estudiar utilizando diversas complementariedades de ácido nucleico/ácido nucleico, por ejemplo, por transferencia Northern o Southern. La función y la expresión de proteínas se pueden estudiar utilizando reacciones proteína/proteína, por ejemplo por transferencia Western.

Recientemente se ha desarrollado un nuevo procedimiento analítico llamado método de micromatrices de ADN (método del chip de ADN) como método para analizar simultáneamente la expresión de múltiples genes, que está despertando mucho interés. En principio, estos métodos son idénticos a los convencionales en el sentido de que son métodos de detección de ácidos nucleicos y de determinación cuantitativa basados en reacciones de hibridación ácido nucleico/ácido nucleico. Estos procedimientos se pueden aplicar a los métodos de detección y determinación cuantitativa de proteínas y cadenas de glúcidos a partir de interacciones específicas proteína/proteína, cadena de glúcido/cadena de glúcido o cadena de glúcido/proteína. Estos métodos se caracterizan por la utilización de un sustrato plano de vidrio llamado "micromatriz" o "chip de ADN" sobre el que se inmovilizan ordenadamente y con una densidad elevada múltiples fragmentos de ADN, proteínas y cadenas de glúcidos. Entre los ejemplos típicos del método del chip de ADN, se incluyen un método en el que se hibrida, por ejemplo, un gen expresado en la célula investigada con una muestra marcada con un colorante fluorescente fijada sobre un substrato plano, se permite que los ácidos nucleicos complementarios (ADN o ARN) se unan entre sí y se analizan los sitios de reacción con un dispositivo de detección de alta definición (escáner) a alta velocidad, y un método de detección de una respuesta, por ejemplo de la corriente eléctrica, basado en una reacción electroquímica. De este modo, es posible estimar rápidamente la cantidad de un determinado gen presente en la muestra. La aplicación de los chips de ADN no se limita al análisis de la expresión génica para estimar la cantidad de gen expresado, y se han depositado muchas esperanzas de que sirva como medio de detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) .

Por ejemplo, se ha desarrollado un procedimiento que consiste en el recubrimiento de un sustrato plano, tal como un vidrio portaobjetos, con poli-L-lisina, aminosilano o similares, y la posterior inmovilización de ácidos nucleicos mediante un dispositivo de fijación llamado "spotter", como método de inmovilización de un ácido nucleico sobre un sustrato (solicitud de patente japonesa publicada 10-503841) .

Los ADNc y fragmentos de los mismos que tienen cientos de miles de bases y que se han utilizado tradicionalmente como sonda de ácido nucleico (ácido nucleico inmovilizado sobre un sustrato) para su utilización en chips de ADN están siendo progresivamente reemplazados por secuencias oligonucleotídicas (ADN con un número de bases comprendido entre 10 y 100) , ya que las mismas reducen el número de errores durante la hibridación con el analito y se pueden preparar fácilmente en un sintetizador. Las secuencias oligonucleotídicas están unidas covalentemente a la placa de vidrio (solicitud de patente japonesa publicada 2001-108683) .

Actualmente, los chips de ADN se utilizan principalmente como herramienta de investigación para analizar un gran número de genes a la vez, disponiendo desde decenas de miles a varios miles de genes en un único chip. Se espera que los chips de ADN se puedan utilizar más ampliamente en aplicaciones de diagnóstico. En general, se prevé que cuando el chip de ADN se utilice en aplicaciones de diagnóstico, la cantidad de muestra recogida será muy pequeña. Los chips de ADN actuales todavía presentan una sensibilidad insuficiente y, por lo tanto, resulta imposible analizar dicha muestra. Además, con los chips de ADN actuales, la intensidad de fluorescencia de los genes con una menor cantidad de expresión después de la hibridación es muy baja y, por lo tanto, dichos chips continúan presentando el problema de que es prácticamente imposible analizar dichos genes. Por consiguiente, los chips de ADN actuales plantean el problema de cómo aumentar la intensidad de fluorescencia después de la hibridación de las muestras de menor cantidad y de los genes con una menor cantidad de expresión. Para resolver este problema, resulta esencial mejorar la eficiencia de la reacción entre el ADN analito y el ADN sonda. Para acelerar la reacción entre el ADN analito y la sonda, la difusión natural del analito resulta insuficiente, de modo que se ha pensado en acelerar eficazmente la reacción entre la sonda y el analito mediante la agitación de la solución.

Por ejemplo, como procedimiento de agitación de una solución de analito, las solicitudes de patente japonesa publicadas 2003-248008 y 2003-339375 dan a conocer un procedimiento para aumentar la eficacia de la reacción con un analito mediante la agitación de una solución de analito por efecto del movimiento de bolas magnéticas presentes en dicha solución mediante una fuerza magnética. Alternativamente, la solicitud de patente japonesa publicada 2003-339375 da a conocer un procedimiento para aumentar la señal después de la hibridación, poniendo en contacto una solución de analito que contiene bolas con un chip de ADN, sellando dicha solución, por ejemplo, con un vidrio cubreobjetos, y haciendo que las bolas caigan en dirección gravitatoria mientras se hace girar el chip, con lo que se agita la solución de analito. En el documento JP 2003-329679 se da a conocer otro procedimiento de agitación de una solución.

Sin embargo, los procedimientos descritos en la solicitud de patente japonesa publicada 2003-248008 y 2003339375 siguen presentando los siguientes problemas.

En general, cuando una solución de analito se sella con un vidrio cubreobjetos convencional sobre un chip de ADN en forma de placa plana, la separación entre el vidrio cubreobjetos y el chip de ADN es aproximadamente, como máximo, de 10 Im. Este hecho conlleva el problema de que las partículas finas con un diámetro mayor que dicha separación, cuando se incorporan, quedan fijadas en dicho espacio libre entre el chip de ADN y el cubreobjetos, con lo que el movimiento queda impedido y la agitación resulta ineficaz. Además, la utilización de partículas finas de diversos Im de diámetro presenta el problema de que las partículas finas no se mueven eficazmente en la solución de analito por culpa de la resistencia de la solución aunque se vean forzadas por la gravedad o una fuerza similar, lo que da lugar a una agitación insuficiente. El contacto entre las partículas finas y el portador sobre el que se inmoviliza la sonda de ADN parece ser una razón para dicha característica de agitación insuficiente aunque se fuerce la migración de dichas partículas finas mediante gravedad. Alternativamente, la solución se puede mezclar por agitación de las partículas finas presentes en la solución de reacción, ampliando la separación entre el vidrio cubreobjetos y el chip de ADN, por ejemplo con una junta tórica, aumentando el tamaño de las partículas finas de agitación y forzando su movimiento mediante una fuerza gravitatoria o magnética. Sin embargo, el vidrio cubreobjetos y el chip de ADN tienen ambos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de agitación de una solución, que comprende poner en contacto una sustancia de enlace selectivo (1) inmovilizada sobre la superficie de un portador (3) con una solución contenida en un recipiente (4) que contiene un analito que reacciona con dicha sustancia de enlace selectivo (1) , y mezclar partículas finas (2) en la solución que contiene dicho analito, y mover dichas partículas finas (2) sin permitir el contacto de las mismas con la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo, caracterizado porque el portador (3) o el recipiente para la solución (4) tiene una estructura tal que las partículas finas (2) no se ponen en contacto con la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo y la anchura mínima de las partículas finas (2) es mayor que la distancia mínima entre la superficie sobre la que se ha inmovilizado la sustancia de enlace selectivo y el recipiente para la solución (4) .

2. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 1, en el que el portador (3) tiene una superficie convexo-cóncava y la sustancia de enlace selectivo (1) se inmoviliza sobre la cara superior de las zonas 15 convexas (12) .

3. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 1, en el que el recipiente (4) para la solución tiene una estructura convexo-cóncava y la sustancia de enlace selectivo se inmoviliza bajo las zonas convexas de dicho recipiente.

4. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 1, en el que tanto el portador (3) como el recipiente (4) tienen una estructura convexo-cóncava.

5. Procedimiento de agitación de una solución, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la 25 solución se agita por el movimiento de las partículas finas (2) .

6. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 2, en el que la solución se agita por el movimiento de las partículas finas (2) , el portador (3) tiene una superficie convexo-cóncava, la sustancia de enlace selectivo (1) es inmovilizada sobre la cara superior de las zonas convexas (12) del portador y las partículas finas se mueven en la zona cóncava.

7. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 2, en el que el portador (3) tiene una zona plana (11) y una zona convexo-cóncava, y la altura de la cara superior de las zonas convexas (12) es prácticamente la misma, y la diferencia de altura entre la zona plana (11) y la cara superior de las zonas convexas es de 50 Im o menor.

8. Procedimiento de agitación de una solución, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las partículas finas (2) son forzadas a moverse por gravedad, fuerza magnética, vibración del portador o una combinación de las mismas.

9. Procedimiento de agitación de una solución, según la reivindicación 6, en el que la anchura máxima de las partículas finas es de 10 Im o mayor, y es menor que la diferencia de altura entre la cara superior de las zonas convexas (12) y la zona cóncava del portador.

45 10. Procedimiento de agitación de una solución, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia de enlace selectivo (1) es un ácido nucleico.

11. Procedimiento de agitación de una solución, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia de enlace selectivo (1) reacciona con el analito. 50