Un procedimiento para medir la inhibición de la agregación plaquetaria mediante un antagonista P2Y12,

que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre que contenga plaquetas de un individuo tratado con un antagonista P2Y12;

b) poner en contacto dicha muestra de sangre que contiene plaquetas con partículas que comprenden un ligando receptor GPIIb/IIIa unido, adenosina difosfato (ADP) y prostaglandina E1 (PGE1) en condiciones adecuadas para la aglutinación de dichas partículas mediada por dichas plaquetas en dicha muestra de sangre; y

c) evaluar dicha aglutinación para determinar el nivel de inhibición de agregación plaquetaria de dicho antagonista P2Y12 en dicho individuo, en el que dicho nivel de aglutinación indica si dicho individuo tiene una capacidad reducida para producir agregación plaquetaria en respuesta a dicho tratamiento con el antagonista P2Y12.

Activación selectiva de plaquetas para el seguimiento de terapia con antagonistas de adp

Campo de la Invención:

Esta invención se refiere al campo de los ensayos para el diagnóstico y, en particular, a la determinación de la función de la actividad plaquetaria en muestras sanguíneas para el estudio de los efectos de las composiciones antiplaquetarias, y más específicamente al doble uso de un activador de las plaquetas (como el ADP) y un inhibidor de las plaquetas (como la Prostaglandina E1 (PGE1) ) para la medida de la función plaquetaria de los inhibidores P2Y12, incluso el clopidogrel, CS-747 (Sankyo) y la ticlopidina de sensibilidad aumentada.

Descripción de la Técnica Mencionada:

El papel de las plaquetas en la fisiología de los mamíferos es extraordinariamente variado, pero su papel primordial es promover la hemostasis. En algunas situaciones, se desea una evaluación de la capacidad de la sangre para la coagulación, un parámetro que frecuentemente se controla por la capacidad de adhesión y/o agregación de las plaquetas. Por lo tanto, es de interés la evaluación de las funciones adhesivas de las plaquetas. Por ejemplo, cuestiones de interés incluyen si administrar fármacos que bloquearán, o promoverán, la formación de coágulos, o si detectar deficiencias en la función plaquetaria antes de los procedimientos quirúrgicos. También es de interés la evaluación de la eficacia de un inhibidor de las plaquetas que se está ensayando como un nuevo fármaco o que se está usando como tratamiento clínico aprobado en un paciente.

Se sabe que las plaquetas se agregan en una variedad de condiciones y en presencia de un número de diferentes reactivos. La agregación de las plaquetas es un término usado para describir la unión de las plaquetas entre sí. La agregación de las plaquetas in vitro depende de la capacidad de las plaquetas de unir fibrinógeno a sus superficies tras la activación mediante un agente inductor de la agregación como el ADP o el colágeno.

Las plaquetas juegan un papel crítico en el mantenimiento de una hemostasis normal. Cuando las plaquetas se exponen a un vaso sanguíneo dañado, se adherirán a la matriz subendotelial expuesta. Siguiendo a la adhesión inicial, diversos factores liberados o producidos en el lugar de la lesión, como la trombina, ADP y colágeno activan las plaquetas. Una vez que las plaquetas se activan, se produce un cambio conformacional en el receptor plaquetario glicoproteína GPIIb/llla, permitiéndole la unión con el fibrinógeno y/o con el factor de von Willebrand.

Esta unión del fibrinógeno multivalente y/o las moléculas del factor de von Willebrand mediante los receptores GPIIb/llla en las plaquetas adyacentes da como resultado el reclutamiento de plaquetas adicionales hacia el lugar de la lesión y su agregación para formar tapones hemostáticos o trombos.

La agregometría plaquetaria in vitro es el procedimiento de laboratorio usado para evaluar la capacidad in vivo de las plaquetas para formar agregados anteriores al tapón hemostático. En esta técnica se añade un agente agregante como el ADP

o el colágeno a la sangre entera o al plasma rico en plaquetas y la agregación de las plaquetas se monitoriza. La agregometría plaquetaria es una herramienta de diagnóstico que puede ayudar en el diagnóstico del paciente y en la selección de la terapia. Los ensayos actuales para medir la agregación plaquetaria son caros, consumen mucho tiempo, son engorrosos y, generalmente no son adecuados para el entorno clínico.

Se ha desarrollado recientemente un ensayo rápido de la función plaquetaria y se ha descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.763.199. El ensayo determina el bloqueo del receptor de glicoproteína (GP) en sangre total. La aglutinación de pequeñas perlas de polímero recubiertas con un ligando GPIIb/IIIa tales como el fibrinógeno resulta cuando las perlas se ponen en contacto con la sangre entera que contiene las plaquetas con los receptores de GPIIb/IIIa activados que no están bloqueados. El fallo en la aglutinación indica bien un fallo de los receptores GPIIb/IIIa que llegan a ser activados y/o el bloqueo de los receptores GPIIb/IIIa. En una realización preferida, la adición de un activador de un receptor de trombina conduce a un ensayo que es lo bastante rápido y conveniente para llevarse a cabo como cabecera y que resulta en la aglutinación de pequeñas perlas de polímero en un período de tiempo conocido y conveniente si los receptores GPIIb/IIIa no están bloqueados. El ensayo incluye la capacidad para transferir sangre para su ensayo desde un depósito de colección a un dispositivo de ensayo sin abrir el depósitode colección. Éste ensayo de agregación plaquetaria se puede llevar a cabo al mismo tiempo que el tiempo de coagulación activado (ACT) , que se realiza para evaluar la capacidad de la heparinización.

La agregación plaquetaria juega un papel principal en la patogénesis de la trombosis y en la enfermedad arterial coronaria aguda. La evidencia sugiere que existe una variabilidad significativa en la función plaquetaria en la respuesta a diversos agentes antiplaquetarios. También se ha demostrado que existe una variabilidad interindividual en la agregación plaquetaria cuando los antagonistas P2Y12 tales como el clopidogrel se usan en el tratamiento de pacientes para conseguir efecto de antiagregación. Los resultados de un estudio demostraron que al menos el 10% de los pacientes que recibieron el fármaco no lograron la inhibición de la agregación plaquetaria esperada (Muller I, Besta F, Schulz C, Massberg S, Schonig A, Gawaz M; Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris scheduled for elective coronar y stent placemen Thromb Haemost. 2003 May, 89 (5) :7837) .

El clopidogrel y la ticlopidina son derivados de la tienopiridina que inhiben la agregación plaquetaria. Se cree que inhiben la unión de la adenosina 5-difosfato (ADP) a uno de sus receptores, el receptor P2Y12. La actividad farmacológica del clopidogrel es muy similar a la actividad farmacológica de la ticlopidina. Sin embargo, se ha mostrado que el clopidogrel tiene menos efectos secundarios que la ticlopidina. Basado en la creciente evidencia de la eficacia del clopidogrel en la enfermedad trombótica, el uso de clopidogrel y otros antagonistas P2Y12 probablemente va a aumentar de forma significativa.

Dado que muchos pacientes con enfermedad cardiovascular están tomando actualmente uno de los agentes de tienopiridina, sería beneficioso un procedimiento para la detección de la resistencia a la tienopiridina y evaluación de la eficacia del tratamiento con tienopiridina. De esta manera, existe una necesidad de desarrollar un ensayo que proporcione información acerca de la aspirina y de la tienopiridina, por ejemplo, de la sensibilidad y eficacia del tratamiento con clopidogrel o con ticlopidina en un paciente dado.

Los efectos de estos agentes en la función plaquetaria se han evaluado con agregometría de plaquetas usando ADP, colágeno u otros activadores plaquetarios. Sin embargo, dado que el ADP activa al menos dos receptores diferentes (P2Y1 y P2Y12 y quizá P2X1) , tiene el potencial para una menor especificidad y ruido de fondo. El colágeno es otra alternativa. Sin embargo el colágeno es altamente variable debido a su estructura cuaternaria, que afecta de forma dramática a su capacidad para activar las plaquetas y debido a este hecho se deriva a partir de tejidos biológicos y es sensible a menores cambios en la temperatura y el pH. Ni el colágeno ni el ADP proporcionan especificidad al receptor P2Y12 y por tanto no son la elección óptima por sí mismos para la determinación de los efectos inhibidores del P2Y12. En particular y como se ha mostrado en varios estudios, la elección de la concentración de estos dos agonistas tiene un efecto significativo en el grado de inhibición de los antagonistas P2Y12 que se midió.

Las prostaglandinas (PGs) pertenecen a la ubicua clase de productos químicos conocida como eicosanoides. Se encuentran en prácticamente cada tejido del cuerpo y tienen un espectro muy amplio de actividades biológicas. Los eicosanoides son derivados del ácido araquidónico, un ácido graso poliinsaturado. El término eicosanoides incluye la familia de las prostaglandinas, las prostaciclinas, los tromboxanos y los leucotrienos. Las prostaglandinas (PGs) se dividen en diferentes familias dependiendo de su estructura, cada una designada por una letra (A, E, F, G, H, o I) . Además de esta letra, cada prostaglandina individual porta un dígito... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para medir la inhibición de la agregación plaquetaria mediante un antagonista P2Y12, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre que contenga plaquetas de un individuo tratado con un antagonista P2Y12;

b) poner en contacto dicha muestra de sangre que contiene plaquetas con partículas que comprenden un ligando receptor GPIIb/IIIa unido, adenosina difosfato (ADP) y prostaglandina E1 (PGE1) en condiciones adecuadas para la aglutinación de dichas partículas mediada por dichas plaquetas en dicha muestra de sangre; y c) evaluar dicha aglutinación para determinar el nivel de inhibición de agregación plaquetaria de dicho antagonista P2Y12 en dicho individuo, en el que dicho nivel de aglutinación indica si dicho individuo tiene una capacidad reducida para producir agregación plaquetaria en respuesta a dicho tratamiento con el antagonista P2Y12.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho ADP tiene una concentración final de 2 a 35 μM.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ADP tiene una concentración final de 15 a 20 μM.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha PGE1 tiene una concentración final de 2 a 30 nM.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la PGE1 tiene una concentración final de 20 a 25 nM.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho antagonista P2Y12 es una tienopiridina.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha tienopiridina es clopidogrel.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha tienopiridina es ticlopidina.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha muestra de sangre que contiene plaquetas proviene de un individuo tratado con un antagonista P2Y12 y aspirina.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas partículas comprenden poliestireno o látex.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas partículas comprenden un colorante infrarrojo, el contacto entre la muestra de sangre que contiene plaquetas y las partículas forma una mezcla de ensayo, la aglutinación de dichas partículas mediada por dichas plaquetas que se evalúa mediante la irradiación de dicha mezcla de ensayo con una luz del espectro infrarrojo, y la evaluación de la transmisión de la luz infrarroja de dicha mezcla de ensayo.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho ligando receptor GPIIb/IIIa comprende una sustancia seleccionada del grupo que consiste en fibrinógeno, anticuerpo monoclonal 10E5, anticuerpo monoclonal c7E3, factor von Willebrand, fibronectina, vitronectina, un ligando que tenga la secuencia arginina - glicina - ácido aspártico (RGD) y un péptido o un péptido mimético que imita la secuencia RGD.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el ligando receptor GPIIb/IIIa es fibrinógeno.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, que se realiza a una temperatura en el rango de 30 º C a 40 º C, y el tiempo total de las lecturas a partir del momento del contacto entre la muestra de sangre que contiene plaquetas, las partículas que comprenden el ligando receptor GPIIb/IIIa unido, ADP y PGE1 se encuentra en el rango de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 10 minutos.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre que contiene plaquetas es una muestra de sangre entera.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre que contiene plaquetas es una muestra de plasma.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las partículas, el ADP y la PGE1 están contenidas en un medio de ensayo.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el medio de ensayo tiene un pico de absorción a aproximadamente 800 nm.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

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