Un ácido nucleico que comprende los elementos contiguos siguientes dispuestos en la dirección 5' a 3':

a) un promotor;

b) al menos dos marcadores seleccionables;

c) un sitio de clonación para recepción de un segmento de ácido nucleico, comprendiendodicho segmento una secuencia diana candidata de RNA regulador; y

d) una señal de poliadenilación,estando dichos elementos dispuestos de tal manera que un transcrito dirigido por dicho promotor comprende dichosal menos dos marcadores seleccionables, dicha secuencia diana candidata de RNA regulador, y dicha señal de poliadenilación por este orden.

Ácidos nucleicos y bibliotecas para uso en el análisis funcional de RNAs reguladores tales como microRNAs (miRNAs)

Campo de la Invención

La invención se refiere a materiales tales como ácidos nucleicos y bibliotecas para uso en el análisis funcional de RNAs reguladores tales como microRNAs (miRNAs) , y particularmente al test de o cribado de dianas de RNAs reguladores tales como secuencias de regiones no traducidas (UTR) 3.

Antecedentes de la Invención

Los microRNAs (miRNAs) están reconocidos actualmente como una nueva clase de pequeñas moléculas de RNA reguladoras que regulan la expresión de muchos genes. Se ha demostrado que los mismos median la angiogénesis, la adhesión celular, la proliferación celular y la supervivencia, y juegan un papel importante en la hematopoyesis. Son producidos a partir de transcritos primarios de RNA (pri-miRNAs) que son procesados por la enzima DROSHA en dúplex de aproximadamente 70 pares de bases que son procesados ulteriormente por DICER en dúplex de miRNA de 22 pares de bases. Una cadena del dúplex de 22 pares de bases se asocia con el complejo de silenciación inducido por RNA (RISC) que está direccionado a sitios dentro de la región no traducida (UTR) 3' del mRNA dando como resultado represión de la traducción, escisión del mRNA o inducción de desadenilación. Actualmente se cree que en los humanos, el complejo RISC actúa principalmente por inducción de inhibición específica de la traducción por la fijación a la UTR 3' del mRNA diana y en menor proporción degradación de las dianas de mRNA.

Los microRNAs (miRNAs) son una familia de pequeños RNAs maduros no codificantes de 21 a 25 nucleótidos de longitud. Los mismos regulan negativamente la expresión de los genes codificantes de proteínas. Los miRNAs son procesados secuencialmente a partir de transcritos precursores primarios de miRNA (pri-miRNA) , y regulan la expresión génica a nivel posterior a la transcripción. La expresión de los miRNAs es altamente específica para la etapa tisular y del desarrollo, pero se sabe poco acerca del modo en que se regulan estos patrones de expresión. Se han identificado más de 541 genes miRNA humanos, pero los métodos bioinformáticos recientes predicen que el número está más próximo a 1000. Las estimaciones actuales sugieren que aproximadamente una tercera parte de los RNAs humanos parecen ser dianas de miRNA. Se ha demostrado que los mismos median la angiogénesis, la adhesión celular, la proliferación celular, la supervivencia y juegan un papel importante en la hematopoyesis y el cáncer.

Debido a la homología parcial entre un miRNA y su diana, y a la inhibición de la traducción en lugar de la degradación del mRNA, la identificación de las dianas es una tarea difícil. Se han desarrollado algoritmos bioinformáticos para la predicción de dianas de miRNA basados en la secuencia de "siembra". Los cuatro algoritmosprincipales predicen 101.031 pares miRNA/diana (como promedio 200 dianas por miRNA) . Únicamente 0, 01% (12) de estos pares son predichos por los 4 algoritmos, 2, 8% por 3, 15, 4% por 2 y 81, 8% por un solo algoritmo. De los 465 miRNAs humanos identificados, sólo 57 tienen 103 sitios diana validados experimentalmente en 85 genes.

Hasta la fecha, el papel y las dianas específicas de la mayoría de los miRNAs son desconocidos en gran parte. Esto es debido principalmente a las dificultades en la identificación de dianas debido a que, contrariamente al RNA de interferencia corto (siRNA) , la fijación de miRNAs debida sólo parcialmente a homología con la diana. Adicionalmente, la inhibición de la traducción impide estudios de redes de expresión de mRNA para el descubrimiento de dianas.

A fin de lograr una mejor comprensión acerca de la función de los miRNAs, se han dedicado grandes esfuerzos a la identificación por computadora de dianas de miRNA utilizando diversos algoritmos (v.g., miRBase (Instituto Sanger, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/) , TargetScan (Whitehead Institute for Biomedical Research, http://www.targetscan.org/) and PicTar (New York University, http://pictar.bio.nyu.edu/) ) . Sin embargo, los inconvenientes de estas predicciones son que las mismas generan un número sustancial de positivos falsos. Adicionalmente, las predicciones tienen gran probabilidad de estar inherentemente sesgadas, dado que se basan principalmente en el conocimiento obtenido a partir del muy pequeño número conocido de interacciones miRNA:diana, un tamaño de muestra estadísticamente muy pequeño, que conduce casi con certeza a un sesgo en las predicciones.

El estudio en la técnica anterior de la regulación de los genes de miRNA carece de los instrumentos necesarios para identificación y validación de las dianas, particularmente en lo que respecta a estudios funcionales.

Es sabido que los siRNAs tienen efectos catalíticos y pueden descomponer los mRNAs. Por consiguiente, los siRNAs pueden estudiarse por utilización de un análisis de redes de patrones de expresión antes y después de la adición de siRNAs. Sin embargo, dado que la mayoría de los miRNAs no tienen actividad catalítica que conduzca a la descomposición de mRNAs, estos tipos de análisis no pueden aplicarse al estudio de los miRNAs.

Otra teoría acerca de la función de miRNA en la técnica anterior es que los mismos previenen la extensión del péptido. En este escenario, sería necesario considerar el producto proteínico a fin de analizar el comportamiento del mRNA.

Los métodos de la técnica anterior para la detección de miRNA han estado basados en redes de miRNA. Estas pueden producirse únicamente con el conocimiento de la secuencia del miRNA propiamente dicho. Adicionalmente, se han hecho intentos para estudiar estos fenómenos utilizando PCR en tiempo real para miRNAs específicos. Sin embargo, una vez más, este tipo de análisis está basado en el conocimiento de la secuencia precisa del miRNA.

A fin de comprender mejor la función de los miRNAs, se dedicado grandes esfuerzos a la identificación por computadora de las dianas de miRNA utilizando diversos algoritmos. No obstante, los inconvenientes de estas predicciones son que todas ellas generan un número sustancial de positivos falsos y pueden estar sesgadas dado que están basadas en su mayoría en el conocimiento obtenido a partir de las muy pocas interacciones miRNA:diana conocidas. Así pues, en este campo, la búsqueda de miRNAs candidatos se realiza directamente por técnicas de computadora. Sin embargo, las técnicas de computadora para la búsqueda de miRNAs adolecen de inconvenientes tales como estar inherentemente sesgadas hacia el pequeño número de miRNAs que han sido comprobados de hecho experimentalmente. Dado que el número de miRNAs comprobados es muy pequeño, el conjunto de secuencias de miRNA comprobadas a partir del cual pueden deducirse motivos o dominios conservados, es correspondientemente pequeño. En primer lugar, esto hace difícil extrapolar a partir de la superposición entre los pequeños números de secuencias conocidas para un conjunto más extenso de miRNAs candidatos. En segundo lugar, en cualquier muestra estadísticamente pequeña procedente de un grupo global grande se producirá un sesgo estadístico inherente por azar. Por tanto, dado que el número de miRNAs en el que se basan las predicciones por computadora es muy pequeño, es prácticamente seguro que existe un sesgo estadístico importante en las predicciones.

Adicionalmente, considerando los cuatro algoritmos de predicción principales, únicamente 0, 01% de los pares miRNA/diana están predichos por cada uno de los algoritmos. De hecho, más del 80% de los pares están predichos por uno solo de los algoritmos. Así pues, la identificación o validación exacta de los apareamientos miRNA/diana es un problema en la técnica.

Una dificultad fundamental en el campo es el descubrimiento de una diana para un miRNA. Esto es especialmente difícil dado que se sabe que las dianas de miRNA no son necesariamente idénticas en secuencia a la secuencia de miRNA propiamente dicha.

Un método de la técnica anterior que intenta estudiar o cuantificar la acción de miRNAs el ensayo de la luciferasa de Ambion Inc's. Este ensayo implica la clonación de una diana y la combinación con el miRNA candidato, seguido por un ensayo de luciferasa diseñado para leer cualquier efecto, utilizando el plásmido de Ambion: pMIR-REPORTTM, número de catálogo AM5795. En primer lugar, como se apreciará, es típicamente necesario conocer la diana o diana candidata antes que pueda realizarse... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende los elementos contiguos siguientes dispuestos en la dirección 5' a 3': a) un promotor; b) al menos dos marcadores seleccionables; c) un sitio de clonación para recepción de un segmento de ácido nucleico, comprendiendo

dicho segmento una secuencia diana candidata de RNA regulador; y d) una señal de poliadenilación, estando dichos elementos dispuestos de tal manera que un transcrito dirigido por dicho promotor comprende dichos al menos dos marcadores seleccionables, dicha secuencia diana candidata de RNA regulador, y dicha señal de poliadenilación por este orden.

2. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia diana candidata de RNA regulador es una secuencia diana de microRNA (miRNA) candidata.

3. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un codón de parada localizado entre dichos marcadores seleccionables y dicho sitio de clonación.

4. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual al menos dos de dichos marcadores seleccionables se proporcionan como un marco de lectura abierto que codifica un solo polipéptido que comprende al menos dos marcadores seleccionables.

5. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual dichos marcadores seleccionables comprenden un marcador para selección positiva y un marcador para selección negativa.

6. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicho sitio de clonación tiene insertado en él un segmento de ácido nucleico que comprende una región no traducida (UTR) 3' o una UTR 3' candidata.

7. Una biblioteca UTR 3', comprendiendo dicha biblioteca una pluralidad de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una biblioteca UTR 3' de acuerdo con la reivindicación 7, en la cual dichas secuencias diana de miRNA candidatas están constituidas por cDNA's.

9. Una célula que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una biblioteca de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8.

10. Un método de construcción de una biblioteca UTR 3' que comprende proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, e insertar en dicho sitio de clonación un ácido nucleico que comprende una UTR 3' o una UTR 3' candidata.

11. Un método de construcción de una biblioteca UTR 5' que comprende proporcionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, e insertar en dicho sitio de clonación un ácido nucleico que comprende una UTR 5' o una UTR 5' candidata.

12. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Un método para identificación de una secuencia diana de miRNA que comprende los pasos de

(a) introducir un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia diana de miRNA candidata en una célula hospedadora;

(b) seleccionar una o más células hospedadoras que expresan el primer marcador seleccionable de dicho ácido nucleico;

(c) introducir al menos un miRNA de interés en dicha o dichas células hospedadoras de (b) , y

(d) ensayar la expresión del segundo marcador seleccionable de dicho ácido nucleico en las células de (c) ,

en donde, si las células de (c) no exhiben la expresión del segundo marcador seleccionable, entonces la secuencia diana de miRNA candidata se identifica como una secuencia diana de miRNA.

14. Un método para identificación de identificación de un miRNA activo contra una secuencia diana de miRNA que comprende los pasos de

(a) introducir un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende dicha secuencia diana de miRNA en una célula hospedadora;

(b) seleccionar una o más células hospedadoras que expresan el primer marcador seleccionable de dicho ácido nucleico;

(c) introducir al menos un miRNA de interés en dicha o dichas células hospedadoras de (b) , y

(d) ensayar la expresión del segundo marcador seleccionable de dicho ácido nucleico en las células de (c) ,

en donde, si las células de (c) no exhiben la expresión del segundo marcador seleccionable, entonces el miRNA de interés se identifica como un miRNA activo contra dicha secuencia diana de miRNA.

15. Un método para identificación de un inhibidor de un RNA regulador que comprende los pasos de

(a) introducir al menos un RNA regulador de interés en una célula hospedadora;

(b) introducir un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia diana candidata de RNA regulador en dicha célula hospedadora;

(c) seleccionar una o más células hospedadoras que no exhiben expresión del primer marcador seleccionable de dicho ácido nucleico;

(d) introducir en dichas células hospedadoras una sustancia o ácido nucleico de test;

(e) ensayar la expresión del segundo de dichos marcadores seleccionables en las células de (d) ;

en donde, si las células de (d) exhiben la expresión del segundo marcador seleccionable, entonces la sustancia o ácido nucleico de test se identifica como inhibidora de dicho RNA regulador.

16. Un método para identificación de una secuencia diana de RNA regulador que comprende los pasos de

(a) introducir un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende una secuencia diana candidata de RNA regulador en una célula hospedadora;

(b) seleccionar una o más células hospedadoras que expresan el primer marcador seleccionable de dicho ácido nucleico;

(c) introducir al menos un RNA regulador de interés en dicha o dichas células hospedadoras de (b) , y

(d) ensayar la expresión del segundo marcador seleccionable de dicho ácido nucleico en las células de (c) ,

en donde, si las células de (c) no exhiben la expresión del segundo marcador seleccionable, la secuencia diana candidata de RNA regulador se identifica como una secuencia diana de RNA regulador.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual dicho RNA regulador es un siRNA y en el cual dicha secuencia diana candidata de RNA regulador es una secuencia diana de siRNA candidata.

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