Patrones de péptidos.

Un procedimiento de preparación de un patrón de péptido para espectrometría de masas comprendiendo dicho procedimiento

(a) la identificación de los puntos de escisión de la endopeptidasa en una secuencia de polipéptido parental de interés;

(b) la selección de secuencias de péptido a partir de dicho polipéptido parental que son definidos mediante los puntos de escisión de endopeptidasa de la etapa (a),

(c) la adición de una extensión C-terminal a cada secuencia seleccionada,

en la que si el punto de escisión de endopeptidasa es C-terminal para su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende de 1 a 6 aminoácidos,

en la que si el punto de escisión de endopeptidasa es N-terminal para su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende dicha secuencia de reconocimiento,

en la que si el punto de escisión de endopeptidasa está dentro de su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende el resto de dicha secuencia de reconocimiento de C-terminal para el punto de escisión; y

(d) la síntesis de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos extendida de la etapa (c).

Patrones de péptidos Descripción Campo de la invención La invención se refiere a espectrometría de masas (MS) , en particular a los patrones de péptidos para su uso en aplicaciones de espectrometría de masas, tales como MS en tándem (MSMS) .

Antecedentes de la invención Típicamente, la MSMS no se utiliza en la técnica para cuantificar proteínas de forma rutinaria. El procedimiento más común utilizado para la detección/cuantificación de la proteína sigue siendo el inmunoensayo/ELISA, en particular en entornos clínicos. La MSMS de triple cuadrupolo se emplea de forma habitual para el análisis de moléculas pequeñas. Esto es porque el peso molecular para el análisis eficaz está limitado a aproximadamente 3000 Daltons. Por esta razón, la técnica se suele considerar inadecuada para el análisis de las proteínas que pueden tener masas mucho más grandes. Aunque algunas otras técnicas de EM pueden ser adecuadas para proteínas, como MALDI-TOF, la MSMS es necesaria por su especificidad. Con el fin de superar las dificultades del análisis de proteínas cuyo peso molecular supera los 3.000, éstas se dividen en péptidos. Los péptidos relativamente cortos, por ejemplo los péptidos de 8 aminoácidos, pueden proporcionar una identificación prácticamente específica de una proteína.

En un desarrollo adicional, se desea utilizar la MSMS para las mediciones cuantitativas de la proteína. Los sistemas tecnológicos de MSMS anteriores cuentan sólo con un análisis cualitativo. En el mejor de los casos, los intentos de la técnica anterior sólo han conseguido un resultado semi-cuantitativo. Con el fin de lograr la cuantificación, lo ideal es etiquetar toda la proteína. Esto se ha intentado en conexión con la apolipoproteína E4. Esta proteína se produjo en un sistema de expresión. Esta es una técnica muy trabajosa y cara. El coste de esta técnica es tal que es prohibitivo para el uso rutinario.

En la EM (como MSMS de electrospray) existen problemas relacionados con la interferencia, especialmente a través de efectos de supresión de iones. La supresión de iones se debe a la presencia de compuestos menos volátiles que pueden cambiar la eficacia de la formación de gotas o la evaporación de las gotas, que a su vez afecta a la cantidad de iones cargados en la fase gaseosa que en última instancia llega al detector.

Por lo tanto, un factor importante que puede afectar al rendimiento cuantitativo de una detección de masas es la supresión de iones. Matriz de la muestra, compuestos coeluyentes y otros factores pueden contribuir a este efecto. Los efectos de la ionización pueden ocurrir teóricamente, ya sea en la fase de solución o en la fase gas. La masa y la carga de analitos individuales son factores clave a la hora de hacer que un compuesto sea candidato para la supresión de iones o a la hora de convertir un compuesto en una fuente de supresión de iones para otro. Se ha demostrado que las moléculas con mayor masa suprimirán la señal de moléculas más pequeñas y que los analitos más polares son más susceptibles a la supresión.

La presencia de la supresión de iones u otros efectos deletéreos se puede evaluar a través de protocolos experimentales. La primera implica la comparación de (a) la respuesta del instrumento para los calibradores (incluyendo cualquier patrón interno) inyectada directamente en la fase móvil, (b) la misma cantidad de compuesto añadido a las muestras preextraídas, y (c) la misma cantidad de compuesto añadido a la matriz de espécimen antes de la extracción. El segundo protocolo, que se puede ver como parte de las pruebas de interferencia para un ensayo, implica la inyección de drogas o metabolitos que también pueden estar presentes en la muestra. El hecho de que un medicamento coeluyente no produzca fragmentos de masa similares no significa que este compuesto sea incapaz de suprimir iones.

Otro problema con la MSMS en el análisis de proteínas es un problema de digestión. Típicamente, los péptidos se generan a partir de la proteína por la acción endopeptidasa. La endopeptidasa estándar de la industria para uso en esta aplicación es la tripsina. Obviamente, se requiere una digestión con tripsina eficiente o completa a fin de reducir con éxito la proteína a sus péptidos componentes para el análisis de la MSMS. Para el análisis cuantitativo, es importante que se obtenga una indicación de la digestión con el fin de validar la lectura de los fragmentos peptídicos individuales de la proteína objetivo. A fin de abordar este problema Anderson y Hunter (2006 Mol Cell Proteomics vol 5 pp573-88) clonaron secuencias de ADN para péptidos clínicamente importantes, vinculados y expresados en un sistema de expresión de proteínas libre de células con arginina y lisina isótopas estables añadidas. Esto se traduce en una proteína de fusión marcada que consiste en una serie de péptidos concatenados, que se separarán teóricamente por la acción de la tripsina. Un problema con este enfoque es que los péptidos concatenados no son equivalentes en la estructura secundaria o terciaria a cualquiera de los polipéptidos parentales. Un problema adicional con este enfoque es que la escisión de la proteína es muy probable que se vea dificultada estéricamente debido al gran número de péptidos que se han fundidos juntos. Además, el punto de escisión de la tripsina para muchos de estos péptidos se enmascarará en la estructura tridimensional de una proteína de fusión grande. Incluso si estos puntos con el tiempo se pueden escindir, es probable que tengan baja eficiencia y quizás una cinética de reacción

que podría interferir con el análisis. Además, en el informe de Anderson et al que se utiliza, solo se puede detectar una proporción menor de los productos de digestión de los trípticos pronosticados (17/30 de dichos péptidos no se detectaron de forma reproducible de acuerdo con Anderson) . Además, este péptido etiquetado multi-fusionado es difícil de realizar de acuerdo con Anderson. Incluso si se pudiera reproducir de forma fiable, sigue implicando un sistema libre de células para la producción de la proteína de fusión. Dichos sistemas pueden sufrir el metabolismo de la lisina o la arginina u otros aminoácidos. Esto hace más difícil el control de la gama de productos que se producen. Por otra parte, hay una tasa de error significativa que provoca la introducción de aminoácidos incorrectos en el producto polipéptido fusionado. Esto se produce en la etapa de traducción, de manera que el ARNm que se introduce no se puede traducir con precisión en la proteína en dicho sistema libre de células, provocando errores en el polipéptido que pueden variar y que puede ser tan altos como varios percentiles del producto polipéptido.

Aunque este enfoque se ha optimizado, los fragmentos de péptidos trípticos se preparan típicamente en paralelo, separados de la digestión de la muestra a analizar, y luego se 'pinchan' en la muestra antes del análisis. Claramente, este enfoque es incapaz de controlar la acción endopeptidasa en la muestra a analizar.

Li-Rong et al, (J. Proteome Research, 3, 469-477, 2004) describen los polipéptidos derivables de factor de elongación 2 y albúmina. Los péptidos se obtienen por digestión y luego se utilizan en espectrometría de masas.

La presente invención pretende superar los problemas asociados con la técnica anterior.

Sumario de la invención Los presentes inventores han descubierto que el rendimiento de la MS se puede maximizar mediante la provisión de patrones de péptidos internos. Estos patrones de péptidos se corresponden de forma ventajosa con péptidos de productos digestos trípticos derivados de la proteína de interés.

En contraste con las técnicas anteriores, los presentes inventores han demostrado de forma sorprendente que la tripsina tiene un requisito extremadamente mínimo para extremos C-terminal con el fin de producir una escisión eficaz. Así, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan patrones de péptidos que se corresponden con los fragmentos de péptidos trípticos esperados de una proteína a analizar, con la adición de un extremo C-terminal extremadamente corto para permitir la digestión tríptica eficiente. Mediante el uso de estos patrones, los problemas de supresión de iones pueden controlarse internamente dado que las especies de péptidos a analizar son idénticas en las secuencias de aminoácidos a los patrones de péptidos. Además, estos patrones de péptidos proporcionan un control interno para la digestión tríptica pues es posible analizar esos patrones de péptidos que se han escindido mediante digestión tríptica, ya que perderán el extremo de aminoácidos C-terminal extremadamente corto que se proporciona para "leer" o controlar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de un patrón de péptido para espectrometría de masas comprendiendo dicho procedimiento

(a) la identificación de los puntos de escisión de la endopeptidasa en una secuencia de polipéptido parental de interés;

(b) la selección de secuencias de péptido a partir de dicho polipéptido parental que son definidos mediante los puntos de escisión de endopeptidasa de la etapa (a) ,

(c) la adición de una extensión C-terminal a cada secuencia seleccionada, en la que si el punto de escisión de endopeptidasa es C-terminal para su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende de 1 a 6 aminoácidos, en la que si el punto de escisión de endopeptidasa es N-terminal para su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende dicha secuencia de reconocimiento, en la que si el punto de escisión de endopeptidasa está dentro de su secuencia de reconocimiento entonces la extensión C-terminal comprende el resto de dicha secuencia de reconocimiento de C-terminal para el punto de escisión; y

(d) la síntesis de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos extendida de la etapa (c) .

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en en el que los aminoácidos 1 a 6 de la etapa (c) son idénticos a los aminoácidos 1 a 6 que siguen inmediatamente al punto de reconocimiento de la endopeptidasa en la secuencia del polipéptido de interés

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en en el que los aminoácidos 1 a 6 aminoácidos de la etapa

(c) son de 1 a 5 aminoácidos y dichos 1 a 5 aminoácidos son TCVAD.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que la síntesis del péptido es por medios químicos.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dicho péptido está marcado con isótopo estable.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 en el que dicho isótopo es carbono 13 y/o nitrógeno 15.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dicha endopeptidasa en una endopeptidasa única.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dicha endopeptidasa es seleccionada el grupo que consiste en tripsina y V8.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la endopeptidasa mencionada es tripsina.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido parental es albúmina.

11. Un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en LVNEVTEFAKT, LVNEVTEFAKTC, LVNEVTEFAKTCV, LVNEVTEFAKTCVA, y LVNEVTEFAKTCVAD.