Péptidos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Un péptido que consiste en la secuencia GGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:

10), o unfragmento del mismo, consistiendo dicho fragmento en GGGPGAGSLQPLALEGSLQK (SEQ ID NO: 4),GSLQPLALEGSLQKRGIV (SEQ ID NO: 5), QPLALEGSLQKRGIVEQ (SEQ ID NO: 6) o QPLALEGSLQK (SEQ IDNO: 9).

Péptidos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias La presente invención se refiere a enfermedades autoinmunitarias y, más particularmente, a diabetes sacarina de tipo 1 (T1DM) . El objetivo es el tratamiento de diabetes y otras clases de enfermedades autoinmunitarias usando combinaciones de péptidos novedosos y el uso de las mismas combinaciones de péptidos en bioensayos diseñados para monitorizar este y otras terapias específicas de diabetes. La invención se describirá más específicamente con relación a T1DM, pero la extensión de los principios novedosos descritos en la presente memoria para la terapia de otras enfermedades autoinmunitarias resultará evidente a partir de la descripción subsiguiente.

En T1DM, el sistema inmunitario destruye involuntaria y progresivamente las células del páncreas que preparan insulina (células º) . Hay por tanto una pérdida de inmunotolerancia a las células º. Eventualmente, hay demasiadas pocas células º para asegurar una captación apropiada de la glucosa sanguínea por las células corporales y el paciente sufre diabetes clínica. Los inconvenientes del tratamiento actual para esta enfermedad son bien conocidos, y el esfuerzo de investigación se ha dirigido durante muchos años a conseguir una mejor comprensión del proceso patológico con vistas a producir procedimientos mejorados de diagnóstico temprano y terapias más eficaces. Una terapia eficaz sería aquella que restaurara la inmunotolerancia a células º. Este enfoque tendría que estar acompañado por un procedimiento complementario para la medida de la tolerancia a células º.

Es bien sabido que el ataque autoinmunitario a células º evoluciona mediante la ruta de MHC de clase II, en que las células presentadoras de antígeno (APC) procesan los antígenos de proteínas de células º relevantes y presentan sus epítopos peptídicos ante linfocitos T CD4+, induciendo así citocinas que ayudan a la destrucción de las células º. Un enfoque que se ha propuesto en el estudio de T1DM y otras enfermedades autoinmunitarias ha sido aislar (eluir) los epítopos eficaces del complejo de péptido y molécula de HLA de clase II y explorar el potencial de estos péptidos para diagnóstico y terapia. La patente de EE.UU. 5.827.516 está dirigida a este tipo de enfoque para un gran número de enfermedades y la patente de EE.UU. 6.562.943 aplica esta metodología a T1DM. La referencia a la literatura correspondiente al documento US 6.562.516 es Peakman et al, 1999, titulada “Naturally processed and presented epitopes of the islet cell autoantigen IA-2 eluted from HLA-DR4”, J. Clin. Invest. 104: 1449-1457. El término IA-2 indica proteína de tipo tirosina fosfatasa de islote.

Narendan P et al., Diabetes/Metabolism Research and Reviews 2003; 19: 52-59, se refiere a las respuestas de anticuerpo y linfocito T contra proinsulina e identifica los epítopos de linfocitos T dominantes.

Intentos previos de encontrar una solución Estas divulgaciones anteriormente mencionadas describen la utilidad prevista de estos péptidos aislados de diversos modos, por ejemplo, los siguientes:

(a) Como péptidos bloqueantes Esta idea era que un péptido, por ejemplo uno que se une a la molécula DR4 de HLA de clase II (de aquí en adelante HLA-DR4) , se uniría muy fuertemente a esta molécula de HLA y desplazaría los péptidos implicados en el proceso patológico, evitando así la activación de linfocitos T autorreactivos. Este enfoque se propuso en 1998, antes de apreciar completamente muchas de las complejidades del procesamiento antigénico para derivar péptidos presentados por moléculas de HLA. Por lo tanto, esta propuesta puede ser difícil de ejecutar por las siguientes razones. La manera en que un péptido natural podría bloquear la activación de linfocitos T es mediante intercambio competitivo, de modo que ocupe todos los sitios de unión a HLA posibles y desplace a otros péptidos ocupantes. Incluso el péptido de mayor unión tendría difícil competir para bloquear todos los demás ligandos de unión. El péptido tendría que competir fuera de la célula, donde no están disponibles enzimas catalíticas para ayudar al intercambio peptídico y donde el pH (aproximadamente de 7, 4 extracelular, en contraposición a 5, 0 intracelular) es muy desfavorable para el intercambio peptídico. Se estima que esto requeriría como mínimo varios miligramos de péptidos para conseguir una concentración suficientemente alta para una competencia eficaz. Puesto que las moléculas de HLA se renuevan en cuestión de minutos/horas sobre la superficie celular, el péptido competidor tendría que está constantemente disponible.

Es altamente dudoso que el sistema pudiera soportar esta hipótesis y sabemos que no hay una bibliografía publicada que indique que dichos péptidos y dicha aplicación terapéutica y modo de acción se han realizado y usado. Además, dicho péptido bloqueante sería globalmente inmunosupresor, en lugar de específico de T1DM.

(b) Uso de péptidos alterados Lo que se contemplaba en esta propuesta era alterar la secuencia peptídica natural para que siguiera uniéndose a la molécula de HLA pero, en lugar de activar linfocitos T, enviara una señal ligeramente diferente que anergizaría (“desconectaría”) los linfocitos T, destruiría los linfocitos T o transformaría los linfocitos T en un tipo más benigno. En los años 90, estos ligandos peptídicos alterados (LPA) con propiedades antagonistas se consideraban altamente prometedores.

El enfoque de LPA continúa siguiéndose en enfermedades autoinmunitarias, aunque los ensayos tempranos en personas han sido menos alentadores. El problema parece ser que la alteración del péptido natural puede volverlo inmunogénico. En dos estudios en personas (en pacientes con la enfermedad autoinmunitaria esclerosis múltiple) , los ensayos clínicos se detuvieron porque los pacientes desarrollaban respuestas inmunitarias alérgicas peligrosas al LPA. Estos resultados se reseñaron en la bibliografía científica en 2000 (ref. 1 y 2) a continuación. Un problema adicional era cómo identificar cuáles alteraciones serían exitosas. Este probó ser un trabajo largo y minucioso y no había indicaciones de cuál péptido elegir, cuál aminoácido alterar y a cuál cambiarlo.

1. Kappos, L., G. Comi, H. Panitch, J. Oger, J. Antel, P. Conlon y L. Steinman. 2000. “Induction of a nonencephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in a placebo-controlled, randomized phase II trial. The Altered Peptide Ligand in Relapsing MS Study Group”. Nat. Med. 6: 1176.

2. Bielekova, B., B. Goodwin, N. Richert, I. Cortese, T. Kondo, G. Afshar, B. Gran, J. Eaton, J. Antel, J. A. Frank, H.

F. McFarland y R. Martin. 2000. “Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: results of a phase II clinical trial with an altered peptide ligand”. Nat. Med. 6: 1167.

Finalmente, es digno de mención que hasta la fecha no se ha descrito un bioensayo que sea capaz de medir la tolerancia a células .

Principios generales de la invención De acuerdo con la presente invención, los inventores han evitado los enfoques de la clase anterior y se ha centrado el esfuerzo de investigación en modos de usar péptidos para suprimir las células específicas implicadas en el desarrollo de esta enfermedad. Se ha concentrado en péptidos clave de preproinsulina. Los inventores han desarrollado un enfoque multietapa, incorporando etapas y bioensayos novedosos para mostrar por primera vez que ciertos de estos epítopos peptídicos están implicados crucialmente en el desarrollo de T1DM y pueden utilizarse para conseguir protección natural de la enfermedad.

La presente invención está dirigida, en primer lugar, al problema de cómo inactivar específicamente los linfocitos T CD4+ patogénicos responsables de T1DM. Esto se consigue (a) identificando los péptidos específicos reconocidos por estas células y (b) usándolos en una modalidad terapéutica (denominada “inmunoterapia peptídica”) . En inmunoterapia peptídica (ITP) , el suministro de péptido nativo soluble conduce a la generación/expansión de linfocitos T CD4+ especializados que son reguladores. Los linfocitos T reguladores son capaces de una inhibición específica de las células que dañan los islotes mediante la liberación de citocinas antiinflamatorias, por ejemplo interleucina 10 (de aquí en adelante IL-10) . Los linfocitos T reguladores que actúan mediante la liberación de IL-10 se denominan linfocitos Tr1. La inducción de linfocitos Tr1 mediante ITP es uno de los pocos enfoques terapéuticos que ofrece un resultado en... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que consiste en la secuencia GGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQ (SEQ ID NO: 10) , o un fragmento del mismo, consistiendo dicho fragmento en GGGPGAGSLQPLALEGSLQK (SEQ ID NO: 4) , GSLQPLALEGSLQKRGIV (SEQ ID NO: 5) , QPLALEGSLQKRGIVEQ (SEQ ID NO: 6) o QPLALEGSLQK (SEQ ID NO: 9) .

2. Una composición que comprende un primer péptido según la reivindicación 1, comprendiendo adicionalmente dicha composición un péptido o péptidos que tienen una secuencia o secuencias seleccionadas del grupo que consiste en

a.

75. 75 de IA-2 (SEQ ID NO: 12) ;

b.

85. 72 de IA-2 (SEQ ID NO: 13) ;

c.

70. 36 de IA-2 (SEQ ID NO: 11) ;

d.

75. 75 de IA-2 (SEQ ID NO: 12) .

85. 72 de IA-2 (SEQ ID NO: 13) ;

e.

70. 36 de IA-2 (SEQ ID NO: 11) .

75. 75 de IA-2 (SEQ ID NO: 12) ;

f.

70. 36 de IA-2 (SEQ ID NO: 11) .

85. 72 de IA-2 (SEQ ID NO: 13) ; y

g.

70. 36 de IA-2 (SEQ ID NO: 11) .

75. 75 de IA-2 (SEQ ID NO: 12) .

85. 72 de IA-2 (SEQ ID NO: 13) .

3. Una composición según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento terapéutico o preventivo de diabetes sacarina de tipo 1 (T1DM) .

4. Un péptido o composición según cualquier reivindicación precedente, en que el péptido o cada péptido se conjuga o combina de otro modo con un coadyuvante promotor de tolerancia o células promotoras de tolerancia.

5. Un péptido o composición según cualquier reivindicación precedente, en que el péptido o cada péptido se conjuga o combina de otro modo con células dendríticas u otras células presentadoras de antígeno.

6. Un péptido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es adecuado para administración por vía parenteral o tópica oral, incluyendo inyección intradérmica, subcutánea o intravenosa, o por vía nasal o epicutánea.

7. Un péptido según la reivindicación 1 para su uso en la terapia o la profilaxis de diabetes sacarina de tipo 1 (T1DM) .

8. Un procedimiento de medida del estado de tolerancia inmunológica de un paciente a células u otras células afectadas por, o implicadas en, diabetes sacarina de tipo 1, que comprende las siguientes etapas:

a. Incubar las células mononucleares de sangre periférica del paciente in vitro con cualquiera de los péptidos o composiciones definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y

b. aplicar un análisis ELISPOT de citocina a las células incubadas para cuantificar la producción celular de interferón y e interleucina 10, en el que la tolerancia inmunológica del paciente a células se demuestra por la presencia de un número aumentado de células productoras de interleucina 10 y un número reducido de células productoras de interferón y, en comparación con las presentes antes del tratamiento.

9. El uso de cualquier péptido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento para la terapia o prevención de diabetes de tipo 1.

10. Un procedimiento para valorar el potencial de un péptido para su uso en la terapia o prevención de diabetes de tipo 1, que comprende someter al péptido candidato a un primer ensayo ELISPOT para IFN-y indicativo de una respuesta de linfocitos T patogénicos en la sangre, en el que, en el caso de una respuesta positiva al primer ensayo, se somete el péptido candidato a un segundo ensayo ELISPOT para IL-10 indicativo de una respuesta de linfocitos T reguladores ante el péptido.