Procedimiento de ayuda al diagnóstico de un trastorno.

Un procedimiento para ayudar al diagnóstico de un trastorno en un sujeto,

comprendiendo dicho procedimiento:

analizar l menos dos características de una muestra proporcionada de dicho sujeto mediante análisis EM en el que la muestra es sangre y, en el que dichas características son indicadores de un trastorno, dichas características seleccionadas de:

(i) la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra;

(ii) un metabolito comprendido por dicha muestra; y

(iii) una actividad enzimática comprendida por dicha muestra,

en el que las al menos dos características comprenden (i) la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra y al menos otra característica seleccionada de (ii) y (iii), en el que cada uno de dichas al menos dos características se determina a partir de un análisis multiplexado en la misma muestra única, y

en el que el análisis de la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra comprende

(a) añadir una endopeptidasa a dicha muestra, en el que si se analiza una actividad enzimática comprendida dentro de la muestra, se añade la peptidasa a la muestra después de que la actividad enzimática comprendida dentro de la muestra ha tenido la oportunidad de actuar sobre un sustrato añadido,

(b) analizar los polipéptidos en dicha muestra después del tratamiento con peptidasa,

(c) inferir a partir de (b) información sobre la composición de aminoácidos de dicho polipéptido.

Procedimiento de ayuda al diagnóstico de un trastorno Campo de la invención La invención se refiere a detección selectiva multiplexada de enfermedad. En particular, la invención se refiere a detección selectiva multiplexada de enfermedades hereditarias usando espectrometría de masas.

Antecedentes de la invención La espectrometría de masas (EM) es una potente técnica analítica cualitativa y cuantitativa que se ha introducido en muchos laboratorios clínicos y de investigación durante los últimos 5 años. El coste de los analizadores de EM ha disminuido a un límite que es asequible para una mayoría de los laboratorios. En el laboratorio clínico se usan espectrómetros de masas para medir una amplia gama de analitos clínicamente relevantes. Cuando se aplica a muestras biológicas, la potencia de la EM reside en su selectividad hacia la identificación y cuantificación de compuestos. La EM en tándem (EMEM) es una técnica de EM que ofrece excelentes capacidades analíticas.

La detección selectiva como cribado de neonatos para la enfermedad metabólica hereditaria, el hipotiroidismo congénito, las hemoglobinopatías, la fibrosis quística y una serie de otras afecciones definidas por requisitos locales es ahora obligatoria en muchos países.

La introducción de EMEM para la detección selectiva de metabolitos ha revolucionado tanto el proceso de análisis como el número de afecciones que, potencialmente, pueden someterse a detección selectiva. Típicamente, este sistema implica butilación. Sin embargo, la detección selectiva utilizando análisis directo de los metabolitos es posible.

Los inventores han demostrado previamente la viabilidad de la detección y confirmación de hemoglobinopatías clínicamente significativas por EMEM en un formato analítico adecuado para la detección selectiva de recién nacidos prenatal.

La detección selectiva de metabolitos permite la detección de una amplia gama de metabolitos que son diagnósticos para determinadas enfermedades hereditarias. En algunos centros de EE.UU. y Europa se han incluido hasta 30 afecciones. Sin embargo, para muchas afecciones, los metabolitos medidos fácilmente ofrecen poca sensibilidad y especificidad, por ejemplo, la metionina para la homocistinuria, lo que es un problema.

En el Reino Unido, la detección selectiva se ha restringido a la medición de fenilalanina para el diagnóstico de la fenilcetonuria (FCU) y de octanoilcarnitina para el diagnóstico de la deficiencia de la acilCoA deshidrogenasa de cadena media (DADCM) . Este es un enfoque rentable. Sin embargo, existe el deseo de aumentar el perfil de detección selectiva, lo que podría excluir afecciones que deben someterse a detección selectiva, por limitaciones técnicas, al tiempo que incluyen afecciones con marcadores que tienen una sensibilidad y especificidad bajas. Este enfoque de la técnica anterior provoca numerosos problemas logísticos y clínicos.

La deficiencia de biotinidasa es un ejemplo de una afección ue, en la actualidad, no se somete a detección selectiva para el uso de un metabolito. La deficiencia de biotinidasa se produce en aproximadamente 1 de cada 110.000 nacidos vivos, en función de las variaciones étnicas en la población sometida a detección selectiva. La deficiencia de biotinidasa no diagnosticada puede causar la muerte, ataques resistentes anticonvulsivos, sordera bilateral, degeneración óptica, problemas de la marcha, y una serie de otras afecciones clínicas inespecíficas. Si se diagnostica en el período neonatal y se instaura el tratamiento con dosis farmacológicas de biotina de por vida, el fenotipo clínico se suprime totalmente y el crecimiento y el desarrollo son normales. Si se diagnostica tarde en la vida, algunas manifestaciones clínicas pueden controlarse (por ejemplo, crisis) , pero otras (por ejemplo, la sordera) permanecen. En consecuencia, a pesar de su relativamente baja incidencia en la población, es un candidato a detección selectiva rentable. En muchos centros fuera del Reino Unido, la detección selectiva se realice para el uso de un ensayo separado, la medición de la actividad enzimática directamente, utilizando un ensayo colorimétrico basado en la medición de ácido para-aminobenzoico liberado a partir de ácido biotinil-para-aminobenzoico (PABA biotina) . El ensayo requiere una muestra aparte específica (mancha de sangre) , es muy laborioso, requiere mucho tiempo y es relativamente insensible. No se han descrito metabolitos en sangre útiles para el diagnóstico de la deficiencia de biotinidasa. Por lo tanto, la detección selectiva de biotinidasa de acuerdo con la técnica anterior implica numerosos inconvenientes y problemas.

La tirosinemia de tipo 1 es un ejemplo de una afección con un marcador propuesto que tiene una baja sensibilidad y especificidad. La tirosinemia de tipo 1 (deficiencia de fumarlacetoacetasa) se produce en aproximadamente 1 de cada 300.000 nacidos vivos, en función de las variaciones étnicas en la población sometida a detección selectiva. La tirosinemia de tipo 1 no diagnosticada puede dar como resultado insuficiencia hepática fulminante, coagulopatía, y muerte o raquitismo, crisis de tipo porfiria, complicaciones neurológicas y tumores hepáticos. El trasplante hepático es a menudo el único tratamiento. Si se diagnostica en el período neonatal y se instaura el tratamiento NTBC de por vida, el fenotipo clínico se suprime totalmente y el crecimiento y el desarrollo son normales. En consecuencia, a pesar de su rareza, se considera un candidato de detección selectiva rentable. En muchos casos, la tirosina en la sangre se incrementa, pero esto no es diagnóstico y los incrementos inespecíficos de la tirosina en sangre son

frecuentes en el período neonatal, por lo que es problemático cuanto se intenta usar el nivel de tirosina en sangre como indicador único de la enfermedad. La succinilacetona se considera que es el metabolito de diagnóstico, pero su medición no se integra fácilmente en los sistemas de detección selectiva de metabolitos de la técnica anterior, lo que es un problema. La succinilacetona se reconoció primero porque su inhibición de la enzima porfobilinógeno sintasa (PBG sintasa une dos moléculas de ácido 5-aminolevulínico mediante deshidratación) , cuya inhibición contribuye a las crisis de tipo porfiria. En muchos centros se usa la actividad de la porfobilinógeno sintasa para la detección selectiva de la tirosinemia de tipo 1 o proporcionar una prueba de reserva para las indicaciones iniciales de un aumento de la tirosina. . El ensayo se basa en proporcionar ácido 5-aminolevulínico como sustrato y medir el porfobilinógeno producido. El ensayo requiere una mancha de sangre aparte, es muy laborioso, requiere mucho tiempo y es relativamente insensible. La falta de comprensión del proceso enzimático también plantea problemas en la técnica anterior relacionados con la tirosinemia.

El documento WO2006/025863 divulga un procedimiento para detectar simultáneamente la actividad enzimática metabólica y los niveles de metabolitos utilizando espectrometría de masas.

Nakanishi y col., (J. Mass Spec., 30, 1663 -1 670, 1995) divulga el diagnóstico de hemoglobinopatías de modo que se preparan productos de digestión con tripsina y se analizan mediante espectrometría de masas.

Las actividades enzimáticas se miden generalmente en condiciones estandarizadas y optimizadas. Esta normalización / optimización requiere tampones y condiciones de pH específicos. En consecuencia, los ensayos y las condiciones individuales son casi siempre diferentes, a menudo sorprendentemente diferentes. Por lo tanto, cada ensayo es casi único. Las condiciones de ensayo para una primera enzima de interés rara vez son adecuadas para una segunda enzima o más enzimas de interés, y de hecho, incluso pueden inhibir o inactivarla. Estos son problemas graves cuando se desea llevar a cabo múltiples análisis enzimáticos.

Además, se sabe que los tampones pueden suprimir significativamente la ionización por electropulverización de compuestos importantes. Este es un problema en la técnica. Los intentos de la técnica anterior para resolver este problema emplean típicamente cromatografía para eliminar el tampón de la señal compuesta. Esto es una etapa que requiere tiempo y laboriosa que necesita equipo y conocimientos especializados para llevarla a cabo.

La presente invención busca superar los problemas asociados con la técnica anterior.

Sumario de la invención Los enfoques actuales de la detección selectiva de enfermedades hereditarias no son adaptables a la multiplexación. En la técnica anterior, las enfermedades individuales se someten a detección selectiva usando conjuntos individuales de condiciones optimizadas para las pruebas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para ayudar al diagnóstico de un trastorno en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento: analizar l menos dos características de una muestra proporcionada de dicho sujeto mediante análisis EM en el que la muestra es sangre y, en el que dichas características son indicadores de un trastorno, dichas características seleccionadas de:

(i) la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra;

(ii) un metabolito comprendido por dicha muestra; y

(iii) una actividad enzimática comprendida por dicha muestra, en el que las al menos dos características comprenden (i) la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra y al menos otra característica seleccionada de (ii) y (iii) , en el que cada uno de dichas al menos dos características se determina a partir de un análisis multiplexado en la misma muestra única, y

en el que el análisis de la composición de aminoácidos de un polipéptido comprendido por dicha muestra comprende

(a) añadir una endopeptidasa a dicha muestra, en el que si se analiza una actividad enzimática comprendida dentro de la muestra, se añade la peptidasa a la muestra después de que la actividad enzimática comprendida dentro de la muestra ha tenido la oportunidad de actuar sobre un sustrato añadido,

(b) analizar los polipéptidos en dicha muestra después del tratamiento con peptidasa,

(c) inferir a partir de (b) información sobre la composición de aminoácidos de dicho polipéptido.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que muestra comprende una mancha de sangre seca.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la muestra está tamponada sólo por los componentes de origen natural de los mismos.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha endopeptidasa es tripsina.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polipéptido comprendido por la muestra es uno o más de la hemoglobina, o mioglobina.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el análisis de un metabolito comprendido por dicha muestra comprende analizar la presencia o ausencia de fenilalanina, octanoilcarnitina, o acilcarnitina.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el análisis de una actividad enzimática comprendida por dicha muestra comprende

(a) la adición de un sustrato susceptible a la acción de dicha actividad enzimática a dicha muestra; y

(b) analizar la muestra para determinar la presencia o ausencia de dicho sustrato y / o la presencia o ausencia de un producto de la acción de dicha actividad enzimática que actúa sobre dicho sustrato.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que más de un sustrato sensible a la acción de dicha actividad enzimática se añade y se analiza.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho sustrato o sustratos es /son solubles en agua.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que cada dicho sustrato se añade solo en agua.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha EM es espectrometría de masas con electropulverización-espectrometría de masas (EMEM) .

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada una de las tres características (i) , (ii) y (iii) se analizan.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha muestra es una muestra in vitro.