ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN INMUNOGLOBULINAS QUE PORTAN EPÍTOPOS DE TRP2 Y GP100.

Un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante,

en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos en la misma de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando se expresa el ácido nucleico, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos:

GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3

SVYDFFVWL en CDRH2, y

WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.

Ícidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas que portan epítopos de TRP2 y gp100

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y a su uso como vacunas, codificando los ácidos nucleicos epítopos de linfocitos T contra los que debe inducirse una respuesta inmune. Tales vacunas pueden usarse en el 5 tratamiento de tumores.

En el campo de las vacunas de cáncer e infecciones virales crónicas, se está haciendo evidente que factores distintos de la frecuencia, tales como la avidez funcional de linfocitos T específicos de tumor y vía de sensibilización, son determinantes principales en la maximización de la eficacia de la vacuna. Varios grupos han mostrado que los linfocitos T CD8+ de alta avidez demuestran actividad antitumoral superior (Alexander-Miller, Immunologic Research, 2005: 31: 13-24. Hodge y col, J Immunol 2005; 174: 5994-6004, Valmori y col, J Immunol 2002; 168: 4231-40, Zeh y col, J Immunol 1999; 162; 989-94) . Se ha sugerido que los linfocitos T de alta avidez desempeñan un papel vital en la regresión tumoral en pacientes. Esto se ejemplifica en un estudio en el que se detectaron linfocitos que se infiltran en tumores (TIL) específicos de antígenos de alta avidez en un paciente con regresión tumoral drástica (Khong & Rosenberg, J Immunol 2002; 168: 951-6) . También están apareciendo pruebas que demuestran que la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor autólogos estimulados in vitro es exitosa, posiblemente porque la estimulación in vitro permite la selección de los linfocitos T de alta avidez (Vignard y col., J Immunol 2005; 175: 4797-805, Dudley y col., J Immunother 2001; 24: 363-73, Morgan y col, J Immunol 2003; 171: 3287-95, Rosenberg & Dudley, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101 Supl 2: 1463945) .

Hasta ahora varios grupos han intentado inducir una respuesta inmune celular contra un epítopo predeterminado usando un anticuerpo como un vehículo para ese epítopo. Por ejemplo, el documento WO 96/19584 (Bona y col.) desvela anticuerpos quiméricos en los que se insertan epítopos de linfocitos T en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo y alega que tales anticuerpos quiméricos son adecuados para inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) . Sin embargo, este documento enseña que el ADN debe codificar una 25 proteína funcional. Por lo tanto en el resumen, se indica que “las capacidades funcionales del epítopo y la inmunoglobulina parental se conservan”. Además, en la página 21, se indica “que la inserción del epítopo deseado debería ser en una región del ácido nucleico que codifique la molécula de inmunoglobulina parental que no es esencial para la expresión o función de la molécula de inmunoglobulina parental”. Además, todos los ejemplos en el documento WO 96/19584 muestran que se produce inmunoglobulina intacta tras la inserción del epítopo de linfocitos T.

La Patente de Estados Unidos Nº 7.067.110 desvela un procedimiento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno usando una proteína de fusión de anticuerpo que carece de un dominio de región variable de inmunoglobulina fusionado con el antígeno por un enlace polipeptídico. La proteína de fusión conserva la capacidad de unirse a Fc.

El documento EP0759944 desvela un procedimiento para incorporar epítopos de linfocitos T dentro de una molécula de anticuerpo que se secreta como una proteína de inmunoglobulina intacta y que puede dirigir epítopos de CTL a tumores para hacerlos mejores dianas para CTL.

El documento WO 00/64488 desvela que una respuesta de CTL puede inducirse por un ácido nucleico que codifica un anticuerpo quimérico que tiene epítopos de linfocitos T heterólogos insertados en las CDR pero no la región variable de los mismos, siempre que el ácido nucleico se dirija para expresión en linfocitos B. Puesto que los linfocitos B no pueden estimular respuestas de linfocitos T vírgenes, la vacuna descrita en el documento WO 00/64488 sería útil solamente en el refuerzo de respuestas de linfocitos T preexistentes.

El documento WO 02/092126 desvela que una respuesta de CTL puede inducirse por un polipéptido que comprende un epítopo de linfocitos T heterólogos y la parte de Fc humano que se une al receptor CD64 de alta afinidad. Sin 45 embargo, los presentes inventores han mostrado ahora que la interrupción de la secuencia de anticuerpo insertando un epítopo de linfocitos T, por ejemplo dentro de una CDR inapropiada o incluso dentro de la región variable de un anticuerpo, evita la asociación de cadena pesada y ligera y no se secreta anticuerpo funcional. El ADN que codifica estos anticuerpos plegados de forma errónea genera de forma inesperada respuestas de linfocitos T fuertes. Además, esto no está mediado mediante CD64 puesto que IgG2 humano, que no se une a CD64 de ratón o humano, funciona tan eficazmente como IgG1 humano.

En un aspecto de la presente invención se proporciona un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante, en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando el ácido nucleico se expresa, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos:

55 GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3

SVYDFFVWL en CDRH2, y

WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.

Sin desear quedar ligado a la teoría, la presente invención se basa, al menos en parte, en el concepto de que puede generarse una respuesta a linfocitos T contra un epítopo de linfocitos T específicos (tal como un epítopo de CTL) , por administración de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que incluye el epítopo de linfocitos T pero no epítopos de linfocitos T reguladores. Se cree que el ácido nucleico se capta por células presentadoras de antígenos (APC) , migra a ganglios linfáticos y se presenta directamente o bien se expresa para producir un polipéptido que se secreta y que se capta después por otras APC. El primer ácido nucleico es adecuado para estimular epítopos de linfocitos T auxiliares y el segundo es adecuado para estimular respuestas de CTL. El polipéptido que se codifica por el ácido nucleico idealmente no tiene ningún epítopo de linfocitos T naturales. Los polipéptidos adecuados a este respecto son moléculas inmunes, tales como anticuerpos. Son adecuadas para la práctica de la presente invención cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que no pueden asociarse de modo que la cadena ligera permanece en las APC y de modo que la cadena pesada se secreta.

Se identificó una población de linfocitos T supresores aproximadamente hace 40 años, pero el progreso se ha visto obstaculizado por la falta de técnicas específicas para identificar las células y debido al escepticismo científico con respecto a la existencia de supresión. Sin embargo, Sakaguchi y col. resucitó el interés en las células supresoras en 1995 demostrando que la transferencia de linfocitos con linfocitos T CD4+CD25+ agotados en ratones atímicos provocó el desarrollo de diversas enfermedades autoinmunes en los ratones receptores y que la reconstitución con linfocitos T CD4+CD25+ evitó reacciones autoinmunes en estos ratones (Sakaguchi y col J. Immunol 1995; 155: 1151-1164) . Posteriormente, numerosos estudios en ratones y seres humanos han mostrado que diversas poblaciones de linfocitos T con actividad reguladora desempeñan un papel importante en la supresión de respuestas inmunes (tanto innatas como adaptativas) a antígenos propios (controlando la autotolerancia) (Sakaguchi y col J Immunol 1995; 155: 1151-1184) así como ajenos (Shevach, Immunity 2006; 25: 195-201, Coleman y col, J. Cell Mot. Med 2007; 11: 1291-1325) . Se ha mostrado que el agotamiento de linfocitos Treg en modelos de ratón de cáncer mejora el rechazo de tumores mediado por respuesta inmune endógena (Shimizu, y col, J. Immunol. 1999; 163: 5211-5218, Onizuka y col, Cancer Research 1999; 59: 3128-3133) y la inmunidad antitumoral específica de antígenos (Tanaka, y col, J. Immunother. 2002; 25: 207-217) . Además, el agotamiento de linfocitos Treg aumenta la inmunoterapia tumoral incluyendo vacunación (Tanalca, y col, J. Immunother. 2002; 25: 207-217, Dan y col, J. Clin. Invest. 2005: 115: 3623-3633) y bloqueo de CTLA-4 (Sutmuller y col, J. Exp. Mad. 2001; 194: 823-832) . Además, se aumentan los números de linfocitos Treg en la sangre periférica (Woo y col, Cancer Research 2001; 61: 4766-4772, Curiel y col, Nature Medicine 2004; 10: 942-949, Wolf... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende un promotor no específico y una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante, en el que la molécula de anticuerpo tiene epítopos de linfocitos T heterólogos en la misma de modo que el anticuerpo no puede tomar su conformación nativa cuando se expresa el ácido nucleico, siendo los epítopos de linfocitos T heterólogos:

GTGRAMLGTHTMEVTVYH en CDRH1 y CDRL3

SVYDFFVWL en CDRH2, y WNRQLYPEWTEAQRLD en CDRH3 y CDRL1.

2. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los epítopos de linfocitos T se insertan en el anticuerpo.

3. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los epítopos de linfocitos T se sustituyen en el anticuerpo.

4. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo está humanizado o quimerizado.

6. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo recombinante comprende adicionalmente una secuencia líder.

7. Un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo tiene la secuencia de la Figura 60.

8. Una vacuna que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente y un adyuvante.

9. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. Un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en medicina.

11. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en la estimulación de una respuesta inmune frente a al menos uno de los epítopos de linfocitos T.

12. El uso de un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra al menos uno de los epítopos de linfocitos T.