Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de superficie de hepatitis B media (MHB),

en laque la secuencia de nucleótidos de dicha molécula comprende una región preS2 que comprende una secuencia deinicio preS2, comprendiendo dicha secuencia de inicio preS2 SEC ID Nº 4.

Ácido nucleico pre-S2 de hepatitis B

5 Campo de la invención

La presente se refiere a ácidos nucleicos del virus de la hepatitis B y kits relacionados con los mismos

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis B (VHB) ha infectado más de 2 mil millones de personas en todo el mundo. Provoca una diversidad de enfermedades en seres humanos que varían de infección subclínica leve a hepatitis fulminante y activa crónica. Más de 400 millones de personas especialmente niños y ancianos, están infectados de forma crónica con VHB. El virus de la hepatitis B es 100 veces más infeccioso que el virus del SIDA, pero puede prevenirse, con

acción. Por tanto, el punto central del combate contra VHB incluye vacunación. Una vacuna no es útil para los que ya están infectados con hepatitis B. Si el virus se detecta suficientemente pronto, sin embargo, están disponibles opciones de tratamiento para los infectados de forma crónica. En consecuencia, los ensayos de diagnóstico se han centrado en la identificación de antígenos diana del virus VHB para detección suficientemente temprana.

El genoma del VHB es un ADN circular, parcialmente bicatenario de aproximadamente 3.200 pares de bases de longitud y codifica siete proteínas virales. La envoltura del VHB consiste en tres proteínas glucosiladas (proteínas superficiales de VHB grandes, medianas y pequeñas o LHB, MHB y SHB respectivamente) , que se codifican por el mismo gen, pero se producen a partir de tres sitios de inicio diferentes y comparten el mismo sitio de terminación. Las tres regiones diferentes del gen de proteína de la envoltura, preS1, preS2 y S, codifican LHB, MHB y SHB,

respectivamente (Véase Fig. 1 y Fig. 2) . Estas tres proteínas se expresan en diferentes relaciones y se ensamblan para formar la cápsida exterior del virión de VHB y también forman una partícula viral incompleta. Los ensayos de antígeno de superficie de VHB detectan ambas formas de productos de expresión, viriones y partículas.

Las regiones de las proteínas de VHB se exponen en superficies de la partícula de VHB y pueden ser las dianas de vigilancia inmune. Sin embargo, VHB muestra una alta tasa de mutación debido a su dependencia esencial de la transcriptasa inversa (RT) en replicación, y la escasa capacidad de corrección de RT. En consecuencia, VHB es capaz de evadir la vigilancia inmune y los regímenes de vacunación mediante mutaciones en las proteínas de la envoltura, incluyendo SHB. Además, debido a que algunos métodos de detección de VHB dependen de controlar los epítopos dentro de las proteínas de la envoltura usando anticuerpos anti-SHB, VHB altamente mutable puede

también escapar a la detección. Existe por lo tanto una necesidad continuada en la técnica de métodos y composiciones para detectar VHB.

Sumario de la invención

Se proporciona en este documento una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una MHB, en la que la secuencia de ácido nucleico de la misma comprende una secuencia de inicio de preS2 que comprende SEC ID Nº 4. SEC ID Nº 4 es 5’-RNNATGG-3’, en la que N es A, T, G o Cy R es A o G.

La molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica una 45 SHB, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la misma.

También se proporciona en este documento un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención y una célula huésped que comprende el vector.

También se proporciona en este documento un kit que comprende el vector, o la célula huésped que comprende dicho vector.

Breve descripción de los dibujos

55 La Figura 1 es una representación esquemática de un virión de VHB, incluyendo la mezcla de constituyentes proteicos de la envoltura de VHB LHB, MHB y SHB que se han ensamblado para formar la cápsida exterior. Un ensamblaje similar de estas proteínas forma la partícula incompleta (no mostrada) . La Figura 2 muestra una representación esquemática de la fase abierta de lectura preS1 de VHB y sus regiones preS2 y S. La Figura 2 también muestra un esquema de las proteínas de superficie de VHB (LHB, MHB y SHB) codificadas por el ácido nucleico preS1. La Figura 3 es esquema de mutantes de fase abierta de lectura preS1 y su expresión proteica resultante. La Figura 4 muestra mapeo de epítopos de antígenos se superficie de VHB de origen natural AdA y un control positivo que usa diversos anticuerpos anti-proteína de superficie de VHB. La Figura 5 (comparativa) muestra la antigenicidad de una proteína codificada por preS2 producida a partir de

65 las secuencias preS2 mutantes como se mide usando diversos anticuerpos anti-proteína de superficie de VHB.

La Figura 6 (comparativa) muestra los resultados de muestra a punto de corte (S/CO) medios usando los inmunoensayos de diagnóstico de Abbott en el mercado Auszyme Monoclonal de ARCHITECT HBsAg.

Descripción detallada

La detección y cuantificación apropiada de VHB en muestras clínicas usando un enfoque basado en anticuerpos puede depender de un control de proteínas positivo o calibrador que comprende una mezcla óptima tanto de SHB recombinante como de MHB recombinante. Un sistema de expresión que utiliza un sitio de inicio preS2 no de Kozak y un sitio de inicio S de Kozak de tipo silvestre para expresar proteínas de superficie de VHB, MHB y SHB, da como resultado niveles sub-óptimos de MHB. Los inventores han realizado el descubrimiento de que la alteración del sitio de inicio preS2 de una secuencia no de Kozak a una secuencia de Kozak parcial da como resultado un ácido nucleico capaz de expresar una mezcla de proteínas de superficie de VHB, MHB y SHB con una relación de antigenicidad mejorada entre estas dos proteínas. Resulta sorprendente que la expresión de proteína de superficie de VHB usando un sitio de inicio preS2 Kozak parcial introducido por mutación parece reflejar de forma más precisa

la relación de los antígenos SHB y MHB vistos en muestras clínicas. Puede usarse MHB expresado usando una secuencia modificada tal solo, o con SHB a una concentración o relación conocida como un control positivo para ensayar la reactividad de anticuerpos anti-proteínas de VHB.

1. Definiciones.

La terminología usada en este documento es para el fin de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que sea limitante. Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente indique otra cosa.

Para enumeración de intervalos numéricos en este documento, cada número intermedio entre ellos con el mismo grado de precisión se contempla de forma explícita. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6, 0-7, 0, se contemplan de forma explícita los números 6, 0, 6, 1, 6, 2, 6, 3, 6, 4, 6, 5, 6, 6, 6, 7, 6, 8, 6, 9 y 7, 0.

a. anticuerpo

“Anticuerpo” como se usa en el presente documento puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD

o IgE, o fragmentos o derivados del mismo, incluyendo Fab, F (ab’) 2, Fd y anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser

un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo purificado por afinidad, o mezcla de los mismos que muestra suficiente especificidad de unión por un epítopo deseado o una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede derivatizarse mediante la unión de uno o más restos químicos, peptídicos o polipeptídicos conocidos en la técnica. El anticuerpo puede conjugarse con un resto químico.

b. unido

“Unido” o “inmovilizado” como se usa en el presente documento para referirse a un polipéptido y un soporte sólido puede significar que la unión entre el polipéptido y el soporte sólido es suficiente para ser estable en condiciones de

45 unión, lavado, análisis y retirada. La unión puede ser covalente o no covalente. Pueden formarse enlaces covalentes directamente entre el polipéptido y el soporte sólido o pueden formarse por un reticulador o por inclusión... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de superficie de hepatitis B media (MHB) , en la

que la secuencia de nucleótidos de dicha molécula comprende una región preS2 que comprende una secuencia de 5 inicio preS2, comprendiendo dicha secuencia de inicio preS2 SEC ID Nº 4.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la MHB tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº 1, o una secuencia al menos 90% idéntica a la misma.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, comprendiendo adicionalmente la molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de superficie de virus de Hepatitis B pequeña (SHB) o una secuencia de nucleótidos al menos 50% -99% idéntica sobre una región de 8-100 o más nucleótidos de la misma.

4. Un kit que comprende: 15

(a) un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1; o

(b) una célula huésped que comprende el vector de (a) .