VARIANTES DE GLUCOSA DEHIDROGENASA SOLUBLE, DEPENDIENTE DE PIRROLOQUINOLINA QUINONA.

Variantes de glucosa dehidrogenasa soluble, dependiente de pirroloquinolina quinona La presente invención se refiere a variantes mejoradas de glucosa dehidrogenasa soluble (s-GDH), dependientes de pirroloquinolina quinona (PQQ), a genes que codifican s-GDH mutadas, a proteínas mutantes de s-GDH con especificidad mejorada de sustrato para la glucosa y a diferentes aplicaciones de estas variantes de s-GDH particularmente para determinar concentraciones de azúcar, especialmente de glucosa, en una muestra. Se han caracterizado dos tipos de glucosa dehidrogenasa (EC 1.1.99.17) dependientes de PQQ: Una es (m-GDH) unida a membrana y la otra es soluble (s-GDH). Ninguno de estos tipos comparte ninguna homología de secuencia significativa (Cleton-Jansen, A. M., y otros, Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6; Cleton-Jansen, A. M., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9; Oubrie, A., y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91). También son distintas respecto a su cinética y también a sus propiedades inmunológicas (Matsushita, K., y otros, Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555). Las quinoproteínas utilizan quinona como co-factor para oxidar alcoholes, aminas y aldosas a sus correspondientes lactonas, aldehídos y ácidos aldólicos (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84, Davidson, V. L. - in "Principles and applications of quinoproteins" (1993), todo el libro, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem J 320 (1996) 697-711 ;Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21). Entre las quinoproteínas, las que contienen el co-factor unido de forma no covalente 2,7,9tricarboxi-1H-pirrolo [2,3-f]quinolina-4,5-diona (PQQ) constituyen el subgrupo más importante (Duine 1991, supra). Todas las dehidrogenasas de glucosa bacterianas conocidas hasta el momento pertenecen a este subgrupo siendo PQQ el grupo protésico (Anthony y Ghosh 1997, supra, Goodwin y Anthony 1998, supra). En las bacterias hay dos tipos completamente distintos de glucosa dehidrogenasas dependientes de PQQ (EC1.1.99.17): el tipo soluble (s-GDH) y el tipo unido a membrana (m-GDH) (Duine y otros, 1982; Matsushita y otros, 1989a,b). Los m-GDH están extendidos entre las bacterias gram-negativas, las s-GDH, no obstante, se han encontrado solamente en el especio periplasmático de cepas de Acinetobacter, tales como A. calcoaceticus (Duine, 1991a; Cleton-Jansen y otros, 1988; Matsushita y Adachi, 1993) y A. Baumannii (JP 11243949). Por investigación de bases de datos de secuencias se han identificado dos secuencias homólogas a la A. calcoaceticus s-GDH de longitud completa en E.coli K-12 y Synechocystis sp. Además, se han encontrado también dos secuencias incompletas homólogas de A. calcoaceticus s-GDH en el genoma de P.aeruginosa y Bordetella pertussis (Oubrie y otros 1999a), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de estas cuatro proteínas no caracterizadas están íntimamente relacionadas con A. calcoaceticus s-GDH con muchos residuos en el lugar putativamente activo conservados de manera absoluta. Estas proteínas homólogas es probable que tengan una estructura similar y que catalicen reacciones similares dependientes de PQQ (Oubrie y otros, 1999a). Las s-GDH y m-GDH bacterianas, se ha observado que poseen secuencias muy diferentes y diferente especificidad de sustrato. Por ejemplo, la A. calcoaceticus contiene dos dehidrogenasas de glucosa dependientes de PQQ distintas, una m-GDH que es activa in vivo y la otra, indicada s-GDH para la que se puede demostrar solamente actividad in vitro. Cleton-Jansen y otros, (1988;1989a,b) clonaron los genes que codifican para dos enzimas GDH y determinaron las secuencias de ADN de estos dos genes de GDH. No hay homología evidente entre m-GDH y s- GDH corroborando el hecho de que m-GDH y s-GDH representan dos moléculas completamente diferentes. El gen de s-GDH procedente de A. calcoaceticus ha sido clonado en E. coli detrás de una secuencia líder y un promotor fuerte. Después de ser sintetizado en la célula, el s-GDH es trasladado a través de la membrana citoplasmática hacia dentro del espacio periplásmico (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press, Matsushita, K. y Adachi, O. Bacteria quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). Igual que los s-GDH nativos procedentes de A. calcoaceticus, s-GDH expresado en E. coli es también un homodímero con una molécula de PQQ y tres iones calcio por monómero (Dokter y otros, 1986 supra,1987 supra1988 supra; Olsthoorn, A. y J. Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Oubrie, A., y otros, J Mol Biol 289 (1999) 319-33, Oubrie, A., y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91, Oubrie, A., y otros, Embo J 18 (1999) 5187-94). La s-GDH oxida una amplia gama de mono y disacáridos a las correspondientes cetonas que hidrolizan adicionalmente a los ácidos aldónicos y también es capaz de donar electrones a PMS (metosulfato de fenazina), DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol), WB (Wursters blue) (Azul de Wurster) y ubiquinonas de cadena corta, tales como ubiquinona Q1 y ubiquinona Q2 (Matsushita, K., y otros, Biochemistry 28 (1989) 6276-80; Matsushita, K., y otros, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), varios aceptadores de electrones artificiales tales como metil sulfato de N-metilfenazonio (Olsthoorn, A. J. y Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8 ; Olsthoorn, A. J. y Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61) y polímeros electroconductores (Ye, L., y otros, Anal. Chem. 65 (1993) 238-41). 2   En vistas de la alta actividad específica de las s-GDH hacia la glucosa (Olsthoorn, A. J. y Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) y su amplia especificidad de aceptador de electrones artificial, la enzima es muy adecuada para aplicaciones analíticas, particularmente para su utilización en biosensores o tiras de pruebas para determinada acción de glucosa en aplicaciones de diagnóstico (Kaufmann y otros, 1997 supra). La oxidación de la glucosa puede ser catalizada, como mínimo, por tres grupos de enzimas completamente distintas, es decir, por dehidrogenasas de glucosa enlazadas por covalente, dependientes de NAD, por flavoproteína glucosa oxidasa o por las GDH de quinoproteína (Duine 1995). Se ha observado una autooxidación más bien lenta de s-GDH reducidas, demostrando que el oxígeno es un mal aceptador de electrones para s-GDH (Olsthoorn y Duine 1996). La s-GDH puede ceder electrones eficazmente a PMS, DCPIP, WB y a ubiquinonas de cadena corta, tales como Q1 y Q2, pero no puede ceder eficazmente electrones directamente al oxígeno. Las tiras tradicionales de pruebas y sensores para controlar el nivel de glucosa en sangre, suero y orina, por ejemplo, de pacientes diabéticos, utilizan glucosa oxidasa. No obstante, dado que la glucosa oxidasa transfiere sus electrones al oxígeno, es conocido que el oxígeno puede tener un impacto negativo en las mediciones de glucosa que se basan en esta enzima. La ventaja más importante de las dehidrogenasas de glucosa dependientes de PQQ es su independencia del oxígeno. Esta importante característica se explica, por ejemplo, en el documento US 6.103.509 en el que se han investigado algunas características de GDH unida a membrana. Una importante aportación en este sector ha sido la utilización de s-GDH junto con sus sustratos apropiados. Se dan a conocer en detalle métodos de ensayo y dispositivo de banda de pruebas basados en s-GDH en el documento US 5.484.708. Esta patente contiene también información detallada en la organización de ensayos y producción de tiras de pruebas basadas en s-GDH para la medición de glucosa. Los métodos descritos en aquél documento, así como los documentos citados, se incluyen en el actual a título de referencia. Otras patentes o solicitudes relativas al sector y que comprenden información específica de varias modalidades de aplicaciones para enzimas con actividad dehidrogenasa de glucosa son los documentos US 5.997.817; US 6.057.120; EP 620 283; y JP 11-243949-A. Un sistema comercial que utiliza s-GDH y un indicador que produce un cambio de color cuando tiene lugar la reacción (Kaufmann y otros, 1997) es el sistema Glucotrend® distribuido por Roche Diagnostics GmbH. A pesar de las importantes ventajas que se han descrito, existe también un problema importante intrínseco de s- GDH. s-GDH tiene más bien un espectro de sustrato amplio en comparación con m-GDH. Es decir, s-GDH oxida, no solamente... [Seguir leyendo]

1. Mutante de forma soluble de EC 1,199,17, también conocida como dehidrogenasa de glucosa soluble dependiente de PQQ (s-GDH) estando caracterizado dicho mutante porque, con respecto a la enzima de tipo natural correspondiente y con respecto, como mínimo, a otro sustrato de azúcar seleccionado, tiene, como mínimo dos veces, una mayor especificidad de sustrato incrementada, para la glucosa, de manera que dicha mejora de la especificidad se calcula de acuerdo con la fórmula: actividad mutante glucosa actividad azúcar seleccionado tipo natural especificidad (mejora) = -------------------------------------------X----------------------------------------------------actividad glucosa tipo natural actividad mutante azúcar seleccionado, en la que dicho mutante comprende una sustitución de residuo de aminoácido en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 348 de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida desde A. Calcoaceticus (SEQ ID NO: 24). 2. Mutante, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho azúcar seleccionado es seleccionado del grupo que consiste en maltosa y galactosa. 3. Mutante, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque dicho azúcar seleccionado es maltosa. 4. Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha especificidad del sustrato para la glucosa es mejorada, como mínimo, 3 veces. 5. Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha especificidad del sustrato para la glucosa es mejorada, como mínimo, 5 veces. 6. Mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la s-GDH de tipo natural es aislada de una cepa del grupo de la especie Acinetobacter que consiste en A. calcoaceticus y A. baumannii. 7. Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según la reivindicaciones 1 a 6, cuyo mutante comprende, como mínimo, otra sustitución del residuo de aminoácido en las posiciones de aminoácido correspondiente con las posiciones de la secuencia de tipo natural del s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24), siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidos del grupo que consiste en las posiciones 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 349, 355, 422, 428 y 438. 8. Mutante, según la reivindicación 7, caracterizado además porque, como mínimo uno de los siguientes residuos de aminoácidos 16, 116, 120, 127, 169, 171, 177, 227, 255, 277, 299, 317, 355 y 438 está sustituido. 9. Proteína mutante, según la reivindicación 7, que comprende sustituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 348 y 428. 10. Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el mutante, como mínimo, 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de la secuencia de tipo natural de s-GDH conocida de A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 24) siendo seleccionadas dichas posiciones de aminoácidos sustituidos del grupo que consiste en las posiciones 171, 227, 230, 245, 341, 348, 349, y 428, en el que ambos residuos de aminoácido T348 y N428 están sustituidos. 11. Mutante, según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado además porque la asparagina en la posición 428 está sustituida por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ofleucina, prolina y valina. 12. Mutante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada además porque la treonina en posición 348 está sustituida por un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, glicina, y serina. 13. Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido de WPXaaVAPS (SEQ ID NO: 1), en la que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de treonina. 14. Proteína mutante, según la reivindicación 13, caracterizada además porque dicho residuio Xaa es glicina. 15. Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido TAGXaaVQK (SEQ ID NO: 2), en el que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de asparagina.   16. Proteína mutante, según la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho residuo Xaa es prolina. 17. Proteína mutante de s-GDH dependiente de PQQ, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, comprendiendo el mutante la secuencia de aminoácido ADGXaaNGL (SEQ ID NO: 3), en el que dicho residuo Xaa es un residuo de aminoácido distinto de asparagina. 18. Mutante, según la reivindicación 17, caracterizada además porque dicho residuo Xaa es seleccionado entre el grupo que consiste en ácido aspártico, ácido glutámico, metionina, prolina, serina, alanina, o glicina. 19. Polinucleótido aislado que codifica al proteína mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 20. Vector de expresión, que comprende un polinucleótido aislado, según la reivindicación 19 enlazado operativamente a una secuencia promotora capaz de promover la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped. 21. Célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 20. 22. Procedimiento para la producción de variantes de s-GDH que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 21, en condiciones apropiadas para la producción de las variantes de enzima. 23. Vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado, según la reivindicación 20, enlazado operativamente a una secuencia promotora capaz de promover suexpresión en un sistema de síntesis de péptido libre de células. 24. Procedimiento para la producción de variantes de s-GDH con el constructo de la reivindicación 23, en un sistema de síntesis de péptido libre de células, en las condiciones adecuadas para la producción de dichas variantes de la enzima. 25. Método de detección, determinación, o medición de glucosa en una muestra utilizando mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, comprendiendo dicha mejora el contacto de la muestra con el mutante. 26. Procedimiento, según la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha detección, determinación, o medición de la glucosa es llevada a cabo utilizando un sensor o un dispositivo de banda de pruebas. 27. Dispositivo para la detección o medición de glucosa en una muestra que comprende un mutante de s-GDH, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y otros reactivos requeridos para dicha medición. 31   32   33   34     36   37   38