USO DE PRECURSORES DE ENCEFALINAS Y/O SUS FRAGMENTOS EN DIAGNOSIS MÉDICA.

Método in vitro para detectar un trastorno seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de sepsis,

enfermedades inflamatorias sistémicas, infecciones locales, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad cardíaca coronaria, malaria y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad de Alzheimer (AD), o para determinar el funcionamiento de la barrera hematoencefálica, en donde en una muestra de plasma de un paciente la concentración de una inmunorreactividad asociada al fragmento ENK-fp de proencefalina que consta de los aminoácidos 119 a 159 de la secuencia de aminoácidos completa de la proencefalina según la ID SEC Nº: 1 es determinada por un método inmunodiagnóstico que usa dos anticuerpos que se fijan específicamente a dicho fragmento ENK-fp de proencefalina, fijándose uno de dichos anticuerpos específicamente al péptido según la ID SEC Nº: 2 y fijándose el otro anticuerpo específicamente al péptido según la ID SEC Nº: 3

La presente invención se refiere al uso de un fragmento de proencefalina en diagnosis médica.

Antecedentes de la invención

El gen de la proencefalina A humana (PENK-A) contiene 4 exones y codifica para una serie de oligopéptidos estructuralmente relacionados tales como metionina-encefalina (Met-ENK), leucina-encefalina (Leu-ENK) y metioninaencefalina-arginina-fenilalanina (Met-ENK-Arg-Phe), así como metionina-encefalina-arginina-glicina-leucina (Met-ENK-Arg-Gly-Leu), en donde una molécula de proencefalina comprende las secuencias de 4 Met-ENKs y una Leu-ENK, una Met-ENK-Arg-Phe y una Met-ENK-Arg-Gly-Leu. La Met-ENK-Arg-Phe y la Met-ENK-Arg-Gly-Leu son adicionalmente metabolizadas a Met-ENK. Las encefalinas tienen una función como neurotransmisores, como neuromoduladores y como neurohormonas. La PENK-A además de las encefalinas comprende las secuencias de encelitina y péptido B en su terminal N, así como de sinencefalina en su terminal C, teniendo las mismas una función antibacteriana.

La expresión de proencefalina se produce en el sistema nervioso central, así como en el sistema nervioso periférico. En el cerebro se observan incrementadas concentraciones de PENK en el nucleus caudatus y en el nucleus accubens, en la sustancia gris periacueductal y en el hipocampo, así como en los núcleos del rafe.

Las encefalinas desempeñan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos tales como la percepción del dolor, la regulación de la respuesta al estrés, comprendiendo la regulación hormonal, y la regulación de la formación de hueso, así como la regulación de las respuestas inmunes. La Met-ENK estimula la proliferación de linfocitos B y T, y la Leu-ENK estimula la proliferación de células T ayudantes y células T citotóxicas. Debido a las propiedades inmunorregulatorias de la Met-ENK, esta encefalina está clasificada como citoquina. Los péptidos de las encefalinas endógenas están también implicados en la regulación normal de funciones cardiovasculares tales como la frecuencia cardíaca, la fuerza de contracción y la presión sanguínea arterial.

La encelitina tiene función antibacteriana contra bacterias gram-positivas tales como las Streptococcus aureus, Bacillus megaterium y Micrococcus luteus, si bien no inhibe el crecimiento de bacterias gram-negativas tales como la Escherichia coli, así como el crecimiento de los hongos. La sinencefalina presenta propiedades antibacterianas contra bacterias gram-positivas así como bacterias gram-negativas.

El nivel de encefalina se encuentra alterado en tejido y fluidos corporales en una variedad de enfermedades. La reactividad inmune de Met-ENK en el plasma de pacientes que padecen de un infarto cerebral en fase aguda y de pacientes de diabetes con isquemia del miocardio sintomática está significantemente incrementada en comparación con individuos de control sanos, así como en el plasma y licor de pacientes que padecen de migraña y cefalea y en licor de pacientes con esquizofrenia.

En la enfermedad de Parkinson el contenido de Met-ENK-Arg-Gly-Leu en el licor de los pacientes está significantemente reducido en comparación con los individuos de control sanos.

Pacientes que padecían de la enfermedad de Alzheimer presentaban una reactividad inmune del tipo de la de Met-ENK 4 veces mayor.

La concentración de RNAm de encefalina en el estriado de pacientes que padecen de la enfermedad de Huntington está significantemente reducida, y en licor se observaba una disminución de la concentración de Met-ENK-Arg-Gly-Leu.

En las enfermedades tumorales los adenomas secretores de prolactina (PL) y de adrenocorticotropina (ACTH) de la hipófisis presentan una incrementada concentración de Met-ENK, así como una concentración de péptidos de proencefalina 10 veces mayor en ésta última.

Las encefalinas desempeñan un papel en la respuesta patofisiológica del tejido nervioso en lesiones traumáticas tales como lesiones de la cabeza y lesiones de la piel por ejemplo durante cirugía y después de la misma.

Las encefalinas desempeñan además un papel importante en la patogénesis de las inflaciones sistémicas. En modelos animales la inducción de una peritonitis o la aplicación de lipopolisacáridos conducen a un incremento de la expresión de PENK, así como a un incremento de las concentraciones de Met-ENK en plasma.

En abscesos de ganado bovino periartrítico pudieron detectarse distintos fragmentos de PENK que comprenden la secuencia de la encelitina. En monocitos periféricos humanos y en linfocitos de rata pudo demostrarse la inducción de expresión de RNAm de PENK por lipopolisacáridos.

La infección de ratas por bornavirus redundó en una incrementada transcripción de PENK-A en el estriado.

La Met-ENK, la Met-ENK-Arg-Phe y los péptidos B y F de proencefalina están significantemente incrementados en plasma durante la hipotensión hemorrágica.

La biosíntesis de encefalinas (véase la Fig. 2) se produce, como en el caso de otras hormonas peptídicas, como preprohormona en ribosomas fijados (al Golgi). Tras la separación de la secuencia señal N-terminal hidrofóbica por las llamadas peptidasas señal y el plegamiento de las proteínas en el lumen del retículo endoplasmático, los propéptidos son empaquetados en vesículas en el aparato de Golgi y son transportados a la membrana celular. Durante el transporte los propéptidos son procesados siendo así convertidos en hormonas maduras por las llamadas prohormona convertasas en secuencias de aminoácidos habitualmente dibásicos. Por medio de distintos estímulos los péptidos son secretados al espacio extracelular o al plasma. Los péptidos maduros son rápidamente inactivados tras la secreción por proteólisis.

Las encefalinas tienen una vida media de 12 a 15 minutos en plasma (ex vivo).

El procesamiento de la proencefalina se produce en varios pasos en un estricto orden en el tiempo y es histoespecífico. Un paso inicial en el procesamiento es la separación del péptido B C-terminal que comprende las secuencias de encelitina y Met-ENK-Arg-Phe. El procesamiento de la proencefalina conduce a la formación de distintos péptidos de proencefalina.

Mediante separación de fases de licor (CSF) (CSF = fluido cerebroespinal) en cloroformo-metanol-agua y HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fase inversa y subsiguiente caracterización de los polipéptidos aislados mediante análisis de secuencias y espectrometría de masas, fue detectada la presencia del fragmento 119-159 de PENK en licor (Stark et al. (2001): Journal of Chromatography Vol. 754, pp. 357-367).

Este fragmento es el fragmento que es determinado según la presente invención, y habitualmente se le llama “huella de encefalina” (ENK-fp) en la presente solicitud.

Pueden detectarse encefalinas en distintos fluidos, tejidos y otros biomateriales corporales.

La corta vida media de las encefalinas en sangre ex vivo ha obstaculizado sin embargo hasta la fecha el uso de las encefalinas en la diagnosis rutinaria. Debido a la corta vida media de las encefalinas, en diagnosis rutinaria no es posible tomar muestras, obtener el plasma, transportar la muestra al laboratorio y hacer la diagnosis en el laboratorio, incluyendo los ensayos requeridos, antes de que las encefalinas alcancen un nivel crítico de detección.

Así, debido a la baja estabilidad in vivo de las encefalinas, su uso como biomarcador se ve extremadamente limitado incluso con una optimizada logística de toma de muestras, puesto que la influencia de la degradación de los péptidos diluye extremadamente la influencia de la biosíntesis y la liberación de encefalinas.

Breve exposición de la invención

La invención en su máximo alcance está definida en las reivindicaciones independientes 1 y 5:

1. Método in vitro para detectar un trastorno seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de sepsis, enfermedades inflamatorias sistémicas, infecciones locales, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad cardíaca coronaria, malaria y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad de Alzheimer (AD), o para determinar el funcionamiento de la barrera hematoencefálica, en donde en una muestra de plasma de un paciente la concentración de una inmunorreactividad asociada al fragmento ENK-fp de proencefalina que consta de los aminoácidos 119 a 159 de la secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para detectar un trastorno seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de sepsis, enfermedades inflamatorias sistémicas, infecciones locales, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad cardíaca coronaria, malaria y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad de Alzheimer (AD), o para determinar el funcionamiento de la barrera hematoencefálica, en donde en una muestra de plasma de un paciente la concentración de una inmunorreactividad asociada al fragmento ENK-fp de proencefalina que consta de los aminoácidos 119 a 159 de la secuencia de aminoácidos completa de la proencefalina según la ID SEC Nº: 1 es determinada por un método inmunodiagnóstico que usa dos anticuerpos que se fijan específicamente a dicho fragmento ENK-fp de proencefalina, fijándose uno de dichos anticuerpos específicamente al péptido según la ID SEC Nº: 2 y fijándose el otro anticuerpo específicamente al péptido según la ID SEC Nº: 3.

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicha determinación de ENK-fp en plasma es llevada a cabo para determinar el funcionamiento de la barrera hematoencefálica, indicando un incremento de la concentración de ENK-fp en plasma en comparación con controles sanos el deterioro o la pérdida de función de la barrera hematoencefálica.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde uno de dichos anticuerpos es etiquetado con un marcador detectable.

4. Método según la reivindicación 3, en donde dicho marcador es un marcador luminiscente.

5. Kit que es para ejecutar un método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y comprende dos anticuerpos que se fijan a dicho fragmento ENK-fp de proencefalina, en donde el primero de dichos anticuerpos se fija específicamente al péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 2, y el segundo de dichos anticuerpos se fija específicamente al péptido que tiene la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 3.