Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares.

Procedimiento para incrementar la producción y/o extracción de fitoesteroles estableciendo cultivos de células vegetales y adicionando al medio ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo

Uso de las ciclodextrinas para la producción y extracción de fitoesteroles en cultivos celulares.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología y la farmacia, y se refiere a un procedimiento para incrementar la producción y extracción de fitoesteroles a partir de cultivos de células vegetales mediante la adición al medio de cultivo de ciclodextrinas y, opcionalmente, jasmonato de metilo.

Estado de la técnica anterior

Los fitoesteroles y los fitoestanoles (formas reducidas de los fitoesteroles) son compuestos derivados del escualeno cuya característica común es la presencia de un anillo esteral, diferenciándose en sus cadenas laterales. Su función principal es la de actuar como componentes estructurales, ya que son constituyentes de las membranas celulares vegetales, aunque algunos fitoesteroles presentan también una acción hormonal (Azcón-Bieto & Talón., 2000. Ed. McGraw-Hill).

Los fitoesteroles pertenecen a la familia de los triterpenos, son esteroles de origen vegetal, cuya estructura química es muy similar a la del colesterol, que se encuentran presentes en los frutos, semillas, hojas y tallos de prácticamente todos los vegetales conocidos (Ling & Jones, 2005. Life Sci. 57:195-206). Por este motivo, los incorporamos normalmente en nuestra dieta. Se estima que la ingesta promedio diaria de fitoesteroles se encuentra en un rango que va desde los 160 mg/día hasta los 500 mg/día. Los fitoesteroles químicamente identificados suman más de 25 estructuras diferentes, pero son sólo tres los que están en mayor proporción: el β-sitosterol (C29), el campesterol (C28) y el estigmasterol (C29), quienes en su conjunto constituyen el 95%-98% de los fitoesteroles identificables en extractos vegetales. Los fitoesteroles comparten con el colesterol el núcleo central de la molécula, la estructura ciclopentano perhidrofenantreno (D-5 insaturado, conservando el grupo -OH que sustituye el carbono 3 de la estructura cíclica). La diferencia estructural de los fitoesteroles con el colesterol radica en la cadena hidrocarbonada lateral. En el colesterol esta cadena está formada por ocho carbonos y es saturada. En los fitoesteroles, la cadena lateral es más larga (9 o 10 carbonos) y en algunos de ellos presenta un doble enlace (estigmasterol). Los fitoestanoles están en menor proporción que los fitoesteroles en el reino vegetal, se forman por la reducción del doble enlace de la posición D-5 de la estructura cíclica. Se ha propuesto que la diferencia estructural en la cadena lateral de los fitoesteroles y de los fitoestanoles con el colesterol es responsable de los particulares efectos hipocolesterolémicos.

Numerosas evidencias experimentales han demostrado que los esteroles vegetales tienen un importante efecto hipocolesterolémico, reduciendo tanto los niveles de colesterol total como los de colesterol ligado a proteínas de baja densidad (LDL) (Varady y cols., 2007. Transl Res 149: 22-30.). El efecto más y mejor estudiado de los esteroles vegetales es la inhibición de la absorción intestinal de colesterol, tanto el procedente de la dieta (300 mg/día) como el colesterol endógeno circulante en la bilis (100 mg/día) que, al ser parcialmente pero extensamente reabsorbido en el intestino, constituye la principal forma de captación. Los esteroles vegetales, al ser más hidrofóbicos que el colesterol, pueden competir con él y desplazarlo de las micelas de absorción, habiéndose demostrado, tanto en estudios in vivo como in vitro, que se produce una disminución de la incorporación del colesterol en las micelas lo que se traduce en una disminución de la absorción intestinal de colesterol. A dosis elevadas de esteroles vegetales la absorción de colesterol disminuye un 30-50% (Ostlund & Lin, 2006. Curr Atheroscler rep 8: 487-491). Además, los esteroles vegetales podrían reducir la tasa de esterificación del colesterol en el enterocito (afectando a la actividad de las enzimas implicadas) y consecuentemente, de esta forma se reduciría la cantidad de colesterol exportado a la sangre en forma de quilomicrones. También se ha sugerido que, en presencia de esteroles vegetales, el colesterol que ya de por si es poco soluble, puede aumentar la tasa de precipitación y por tanto desplazarse a una forma no- absorbible o menos absorbible.

Actualmente, se sabe que los fitoesteroles y fitoestanoles poseen propiedades inmunomoduladoras que podrían ser beneficiosas para la prevención del cáncer de colon (McCann y cols., 2003. J Nutr. 133:1937-1942), cáncer de mama (Awad y cols., 2000. Anticancer Res. 20(2A):821-824.), control de la hiperplasia prostética benigna (Awad y cols., 2001. Eur J Cáncer Prev 10(6):507-513) y daño tisular asociado a inflamación (Lowe & Ku, 1996. Urology 1996; 48:12-20).

Estudios recientes sugieren que una dieta rica en fitoesteroles puede ser fuertemente protectora contra estos tipos de cáncer, desencadenando respuestas como, aumento de la respuesta antitumoral, la inhibición del crecimiento tumoral; también afectan al ciclo celular y promueven la apoptosis a través de la inducción del metabolismo de esfingolípidos y la estimulación de la formación de ceramidas (Awad y cols., 2000. Anticancer Res. 20(2A):821-824). Además, los esteroles aumentan la respuesta celular de los linfocitos T tanto in vivo como in vitro (Bouic y cols., 1996. Int J Immunopharmacol. 18:693-700) y promueven la expresión o actividad de factores endógenos inhibidores de la angiogénesis, proceso necesario para el crecimiento de tumores y desarrollo de la metástasis (Quesada y cols., 2006. Med. Res. Rev. 26:483-530). Asimismo, los fitoesteroles también presentan acción antimicrobiana, antifúngica y antibacteriana (Ling & Jones, 1995. Life Sci. 57:195-206).

Los fitoesteroles más importantes, desde el punto de vista económico, son el β-sitosterol, el campesterol y el estigmasterol. En la actualidad, estos compuestos se obtienen mediante un proceso extractivo de la materia prima vegetal. Este proceso de extracción es de bajo rendimiento ya que a partir de 1.6 kg de hoja seca de Pandanus tectorius se obtienen 26.8 mg de una mezcla de estigmasterol y el β-sitosterol en una proporción 2:1 (Mario y cols., 2008. J Nat Med. 62:232-235). Asimismo, a partir de 5 kg de fruto de banana se obtuvieron 325, 76, y 65 mg/kg de β-sitosterol, campesterol y estigmasterol respectivamente (Oliveira y cols., 2008. J Agric Food Chem. 56(20):9520-9524).

El cultivo in vitro constituye una alternativa a los métodos clásicos de extracción convencional a partir de materia prima vegetal y se trata de un área emergente y de gran potencial de crecimiento para la síntesis de compuestos bioactivos. El cultivo de células vegetales in vitro ha abierto nuevos caminos como fuente de obtención de compuestos bioactivos de gran valor añadido debido a las ventajas que presenta su utilización ya que estos cultivos son independientes de factores geográficos, estacionales y ambientales, reconocidos como sistemas de producción estables ya que aseguran la obtención continua de compuestos con calidad y productividad uniformes y los requerimientos de espacio para el desarrollo de la producción son reducidos. Además, el proceso de purificación del compuesto de interés es más fácil y se optimiza cuando éste se libera al medio de cultivo, la producción del compuesto se puede realizar a gran escala y, existe la posibilidad de obtener productos nuevos que no son sintetizados por las plantas de forma natural. La optimización de la producción de metabolitos incluye el establecimiento de las condiciones óptimas de cultivo y el ajuste de los parámetros de crecimiento celular. Cuando además se quiere comercializar el producto a nivel industrial, es necesario realizar un escalado en sistemas que garanticen la producción elevada del metabolito de interés (en biorreactores) para alcanzar niveles económicamente rentables. Además, existen otros factores que incrementan la productividad entre los que destaca la elicitación del cultivo celular. Mientras que la planta responde a la presencia de elicitores sintetizando metabolitos de forma localizada allá donde se produce la interacción, el cultivo celular responde globalmente, ya que el elicitor entra en contacto con toda la biomasa. Por lo tanto, la cantidad total de metabolitos sintetizados es mucho mayor que en la planta y está en función de la biomasa de células elicitada (Bru y cols., 2006. J Agr Food Chem. 54(1):65-71).

Debido a las propiedades beneficiosas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para incrementar la producción y/o extracción de fitoesteroles que comprende: