Un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo,

de manera que se produce metionina, en el que a)el compuesto de sulfuro rematado con metilo se selecciona del grupo que consiste en disulfuro de dimetilo (DMDS), trisulfuro de dimetilo, tetrasulfuro de dimetilo, b)el microorganismo productor de metionina se selecciona del grupo que consiste en bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, levaduras y Archaea, c)el microorganismo productor de metionina tiene al menos una enzima biosintética de metionina desregulada, seleccionada del grupo que consiste en c1)una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa u O-succinil-homoserina sulfhidrilasa desregulada c2)una homoseriana acetiltransferasa u homoserina succiniltransferasa desregulada y una homoserina deshidrogenasa desregulada c3)una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y una homoserina acetiltransferasa desregulada o una O-succinil-homoserina sulfihídrilasa desregulada y una homoserina succiniltransferasa desregulada

Uso de disulfuro de dimetilo para la producción de metionina en microorganismos.

Antecedentes de la invención

Metionina se produce actualmente en forma de una mezcla racémica de DL-metionina por un proceso químico bien establecido que implica materiales o compuestos intermedios tóxicos, peligrosos, inflamables, inestables y nocivos. Los materiales de partida para la producción química de metionina son acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. La síntesis química de metionina implica la reacción de metilmercaptano y acroleína, para producir el compuesto intermedio 3-metilmercaptopropionaldehído (MMP). El tratamiento ulterior implica hacer reaccionar MMP con cianuro de hidrógeno para formar 5-(2-metiltoetil)hidantoina, que luego se hidroliza utilizando productos cáusticos tales como NaOH, junto con Na₂CO₃, NH₃ y CO₂. Subsiguientemente, DL-metionina sódica se neutraliza con ácido sulfúrico y Na₂CO₃ para proporcionar DL-metionina, Na₂SO₄ y CO₂. Este proceso proporciona un gran exceso de compuestos no utilizados en comparación con la cantidad de metionina producida, que plantea un reto económico y ecológico.

Procesos fermentativos para la producción de metionina se basan típicamente en el cultivo de microorganismos con nutrientes que incluyen fuentes de hidratos de carbono, p. ej. azúcares tales como glucosa, fructosa o sacarosa, fuentes de nitrógeno, p. ej. amoníaco y fuentes de azufre, p. ej. sulfato o tiosulfato junto con otros componentes del medio necesarios. Este proceso proporciona L-metionina y biomasa como un subproducto sin materiales de partida tóxicos, peligrosos, inflamables, inestables y/o nocivos.

Sin embargo, con el fin de que un organismo (p. ej. un microorganismo) produzca metionina a partir de sulfato en calidad de fuente de azufre, el átomo de azufre debe de ser reducido primeramente en sulfuro. Este proceso consume energía, de modo que la alimentación de una fuente de azufre al microorganismo, que es más reducida que el sulfato, mejoraría el proceso. Una fuente de azufre reducida de este tipo es tiosulfato, en el que uno de los dos átomos de azufre ya está reducido. Otra fuente de azufre reducido es metano-tiol, que contiene un átomo de azufre totalmente reducido.

J. Mampel et al. describen en Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005) 68: 228-236, publicado en línea el 25 de enero del 2005, que la inactivación de NCgI2640 daba como resultado una producción significativamente incrementada de metionina. Utilizando fusiones lacZ promotoras de genes implicados en el metabolismo del azufre, demostraron el alivio de la represión de L-metionina en el mutante NCgI2640 para la cisteína sintasa, o-acetilhomoserina sulfhidrilasa (metY) y sulfito reductasa. La complementación de la cepa mutante con NCgI2640 portador de plásmidos restauraba el fenotipo de tipo salvaje para metY y sulfito reductasa.

El uso de metano-tiol para la producción de metionina ofrece dos ventajas. La primera, como se ha mencionado antes, el átomo de azufre ya está reducido. La segunda, se suministra un grupo metilo que podría eludir potencialmente la necesidad de dos de las enzimas que normalmente se requieren para la biosíntesis de metionina, metiltetrahidrofolato reductasa (MetF) y metionina sintasa (MetE y/o MetH). Existen informes en la bibliografía que describen que algunos microorganismos, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, pueden incorporar enzimáticamente metano-tiol directamente en metionina, haciéndola reaccionar con O-acetil homoserina (Yamagata, S. 1971, J. Biochem. (Tokyo) 70:1035). Métodos para el uso de metano-tiol en la producción de metionina se describen también en los documentos WO 93/17112 y WO 2004/076659.

Sin embargo, el uso de metano-tiol para la producción de metionina tiene también inconvenientes. Es un gas explosivo y tóxico que se oxida fácilmente en el aire, y es nocivo. El proceso químico para producir metionina también utiliza metano-tiol como uno de los sustratos, de manera que los ingenieros han aprendido a manipular el compuesto a escala industrial. No obstante, serían de gran beneficio procedimientos mejorados para la producción de metionina que no utilicen metano-tiol.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para la producción de metionina. Los autores de la presente invención han descubierto una fuente de grupos azufre y/o metilo distinta de metano-tiol que puede utilizarse para la producción de metionina. En particular, los autores de la presente invención han descubierto que disulfuro de dimetilo (DMDS - siglas en inglés), al que también se alude como disulfuro de metilo o CH₃-S-S-CH₃, se puede añadir a medios de cultivo y utilizar por parte de un microorganismo como una fuente tanto de un grupo sulfuro como de un grupo metilo, eludiendo la necesidad de una actividad MetH/MetE y MetF y la necesidad de reducir el sulfato para la síntesis de metionina.

Además, la presente invención demuestra que un microorganismo que tiene una vía de biosíntesis de metionina desregulada, p. ej. una O-acetil-homoserina sulfhidrilasa desregulada y/o una homoserina acetiltransferasa desregulada y/o una homoserina deshidrogenasa desregulada, puede utilizar un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), para la síntesis de metionina. Además, los autores de la invención han descubierto que la producción de metionina mediante cepas prototróficas tratadas mediante ingeniería genética que acumulan O-acetil-homoserina, es mejorada mediante la adición de DMDS.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención ofrece un método para la producción de metionina, que comprende cultivar un microorganismo en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. disulfuro de dimetilo (DMDS), de manera que se produce metionina. En una realización, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el cultivo a una concentración de 0,02% o superior. En otra realización, el compuesto de sulfuro rematado por metilo, p. ej. una fuente de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. DMDS, está presente en el cultivo a una concentración de 0,06% o mayor. En otras realizaciones, el compuesto de sulfuro rematado con metilo, p. ej. la fuente de azufre y/o metilo, se selecciona del grupo que consiste en trisulfuro de dimetilo (DMTS - siglas en inglés) o CH₃-S-S-S-CH₃, tetrasulfuro de dimetilo (DMTTS - siglas en inglés) o CH₃-S-S-S-SCH₃.

Otro aspecto de la invención ofrece un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS), de manera que se produce metionina. En una realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de azufre y/o metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es Amberlite^TM XAD4. En una realización, el sistema de suministro de liberación lenta libera DMDS a una concentración que totaliza 0,1% o mayor en el medio de cultivo. Todavía en otra realización, el sistema de suministro de liberación lenta libera DMDS a una concentración que totaliza 0,3% o mayor en el medio de cultivo. En una realización, el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve DMDS. En una realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con metilo de liberación lenta, p. ej. un sistema de suministro de un grupo azufre y/o metilo, p. ej. un sistema de suministro de DMDS de liberación lenta, comprende un líquido seleccionado del grupo que consiste en aceites animales, aceites minerales, aceites químicos, aceites vegetales, aceites sintéticos, un disolvente orgánico, clorocarburos, fluorocarburos, cloro-fluoro-carburos, o combinaciones de los mismos. En otra realización, el sistema de suministro de sulfuro rematado con... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir metionina, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un compuesto de sulfuro rematado con metilo, de manera que se produce metionina, en el que

2. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo pertenece a género Corynebacterum.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo es Corynebacterum glutamicum.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el microorganismo pertenece al género Escherichia.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de aislar la metionina.

6. Uso de un microorganismo recombinante para la producción de metionina en presencia de disulfuro de dimetilo (DMDS), teniendo dicho microorganismo al menos una enzima biosintética de metionina desregulada elegida del grupo:

7. El uso de la reivindicación 6, en el que el microorganismo pertenece al género Corynebacterium.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que el microorganismo pertenece a Corynebacterium glutamicum.

9. El uso de la reivindicación 6, en el que el microorganismo pertenece al género Escherichia.

10. Un método para producir metionina de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que comprende cultivar un microorganismo productor de metionina en presencia de un sistema de suministro de disulfuro de dimetilo (DMDS) de liberación lenta, de manera que se produce metionina.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es Amberlite^TM XAD4.

12. El método de las reivindicaciones 10 y 11, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta libera DMDS en el cultivo a una concentración de 0,1% o mayor.

13. El método de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta libera DMDS en el cultivo a una concentración de 0,3% o mayor.

14. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido que es inmiscible con agua, pero que disuelve DMDS.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende un líquido seleccionado del grupo que consiste en: aceites animales, aceites minerales, aceites químicos, aceites vegetales, aceites sintéticos, un disolvente orgánico, clorocarburos, fluorocarburos, cloro-fluoro-carburos o una combinación de los mismos.

16. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es una alimentación de DMDS lenta controlada.

17. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta es el flujo o la difusión de DMDS a través de una membrana que es permeable a DMDS.

18. El método de la reivindicación 10, en el que el sistema de suministro de DMDS de liberación lenta comprende alimentar DMDS en un estado gaseoso.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el DMDS en un estado gaseoso se genera evaporando o calentando a ebullición DMDS líquido.

20. El método de la reivindicación 18, en el que el DMDS en un estado gaseoso se genera burbujeando aire u oxígeno a través de DMDS líquido.