UN MÉTODO PARA PRODUCIR VACUNAS ANTIGRIPALES POLIVALENTES A BASE DE HEMAGLUTININA.

Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. Antecedentes de la invención La presente invención se sitúa de manera general en el área de las vacunas recombinantes de la gripe. La gripe epidémica se produce anualmente y es causa de una morbilidad y una mortalidad significativas en todo el mundo. Los menores son los que presentan la mayor tasa de ataque, y son los principales responsables de la transmisión de los virus de la gripe en la sociedad. Los mayores y las personas que padecen problemas de salud presentan un riesgo incrementado de padecer complicaciones y necesitar hospitalización tras una infección de gripe. Sólo en los Estados Unidos, se produjeron más de 10.000 muertes durante cada una de las siete temporadas de gripe en el periodo 1956-1988 debido a neumonía y gripe, y más de 40.000 muertes en cada una de dos temporadas (Actualización: Influenza Activity United States and Worlwide, y Composition of the 1992-1993 Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/Nº 18: 315-323, 1992). Los virus de la gripe son partículas altamente pleomórficas compuestas por dos glicoproteínas superficiales, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). La HA media en la unión del virus a la célula hospedante y en la fusión virus-membrana celular durante la penetración del virus en la célula. El genoma del virus de la gripe consta de ocho segmentos de ARN de sentido negativo de cadena sencilla, de los cuales el cuarto segmento en tamaño codifica el gen de HA. Los virus de la gripe se dividen en los tipos A, B y C, en base a diferencias antigénicas. Los virus de la gripe A se describen mediante una nomenclatura que incluye el subtipo o tipo, el origen geográfico, el número de cepa y el año de aislamiento, por ejemplo, A/Pekín/353/89. Existen al menos 13 subtipos de HA (H1-H13) y nueve subtipos de NA (N1-N9). Todos los subtipos se encuentran en aves, pero sólo los H1-H3 y los N1-N2 se dan en humanos, cerdos y caballos (Murphy y Webster, Orthomyxoviruses, en Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock, R.M., 1091-1152 (Raven Press, Nueva York, (1990)). Los anticuerpos de HA neutralizan el virus y forman la base de la inmunidad natural frente a la infección de gripe (Clements, Influenza Vaccines, en Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, páginas 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). La variación antigénica de la molécula de HA es la responsable de los brotes frecuentes de gripe y del limitado control de la infección mediante inmunización. La estructura tridimensional de la HA y la interacción con su receptor celular, el ácido siálico, ha sido ampliamente estudiada (Wilson y col., Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3Aº resolution, Nature 289: 366-378 (1981); Weis y col., Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid, Nature, 333: 426-431 (1988); Murphy y Webster, 1990). La molécula de HA está presente en el virión en forma de trímero. Cada monómero existe en forma de dos cadenas, HA1 y HA2, unidas mediante un único enlace de disulfuro. Las células hospedantes infectadas producen un polipéptido precursor glicosilado (HAO) con un peso molecular de aproximadamente 85.000, que posteriormente se divide en HA1 y HA2. La presencia de anticuerpo IgG e IgA neutralizante específico de la gripe está asociada a resistencia a la infección y a la enfermedad (Clements, 1992). Las vacunas de la gripe de virus entero desactivado o parcialmente purificado (subunidad de separación) están estandarizadas a la cantidad de HA de cada cepa. Las vacunas de la gripe habitualmente incluyen de 7 a 25 microgramos de HA de cada una de tres cepas de gripe. El papel de la otra glicoproteína principal, la NA, en la inmunidad protectora de respuestas de anticuerpo o de células T contra la gripe no ha sido definido. La neuraminidasa es muy lábil al proceso de purificación y almacenamiento (Murphy y Webster, 1990) y la cantidad de NA en la vacuna previene la enfermedad en animales expuestos a la gripe (Johansson y col., Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection, J. Virology, 63: 1239-1246 (1989)). Una vacuna experimental basada en antígeno de neuraminidasa no resultó protectora en un ensayo con humanos (Orga y col., J. Infect. Dis. 135: 499-506 (1977)). Las vacunas contra la gripe licenciadas consisten en preparaciones enteras desactivadas con formalina o de subunidades separadas químicamente de virus de dos subtipos de gripe A (H1N1 y H3N2) y de un subtipo de gripe B. Antes de cada temporada de gripe, el U.S. Food and Drug Administrations Vaccines and Related Biologicals Advisory Committe recomienda la composición de una vacuna trivalente contra la gripe para la nueva temporada. La vacuna de 1992-93 contenía los virus H1N1 tipo A/Texas/36/91, H3N2 tipo A/Pekín/353/89 y B/Panamá/45/90. La FDA ha aconsejado que la vacuna contra la gripe de 1993-94 debería contener las mismas cepas de Texas y Panamá y una nueva cepa de gripe A de Pekín (A/Pekín/32/92). La vacunación de personas con riesgo elevado cada año antes de la temporada de gripe es la medida más eficaz para reducir el impacto de la gripe. Las limitaciones de las vacunas disponibles actualmente incluyen tasas de utilización bajas; baja eficacia en personas mayores y en niños pequeños; producción en huevos; variación antigénica y reacciones adversas. El Centro para el Control de Enfermedad (Center for Disease Control, CDC) estima que menos del 30% de los 2   individuos de alto riesgo frente a la gripe son vacunados cada año (MMWR, 1992). Las vacunas desactivadas actuales alcanzan una elevada tasa de protección contra la enfermedad entre adultos sanos normales cuando los antígenos de la vacuna y los de la gripe en circulación están estrechamente relacionados. Entre los mayores, la tasa de protección contra la enfermedad es mucho menor, especialmente para aquellos que están institucionalizados (Clements, 1992). En un estudio reciente de Powers y Belshe, J. Inf. Dis. 167: 584-592 (1993), se observaron respuestas de anticuerpo significativas a una vacuna contra la gripe de subvirión trivalente en menos del 30 por ciento de los sujetos de 65 años o más. Los virus de simiente para las vacunas de gripe A y B son cepas naturales que se replican con altos valores en la cavidad alantoica de huevos de pollos. Alternativamente, la cepa para el componente de gripe A es un virus reordenante con los genes antígenos superficiales correctos. Un virus reordenante es aquel que, debido a la segmentación del genoma vírico, tiene las características de cada cepa original. Cuando más de una cepa vírica de gripe infectan a una célula, estos segmentos víricos se mezclan para crear un virión de progenie que contiene varias clasificaciones de genes de ambos origines. La protección con las vacunas actuales contra la gripe, totales o de división, es de vida corta y decae según se produce la deriva antigénica en las cepas epidémicas de gripe. Los virus de la gripe sufren una deriva antigénica como resultado de la selección inmune de virus con cambios en la secuencia de aminoácidos en la molécula de hemaglutinina. Idealmente, las cepas de la vacuna coinciden con las cepas del virus de la gripe que provoca la enfermedad. El proceso actual de fabricación de vacunas de la gripe, sin embargo, está limitado por la propagación del virus en huevos de pollo embrionado. No todas las cepas de virus de la gripe se replican bien en huevos; por tanto los virus deben adaptarse o se deben construir reordenamientos víricos. En la hemaglutinina de los virus cultivados en huevo se produce una heterogeneicidad extensiva, en comparación con los elementos aislados primarios de los individuos infectados cultivados en células de mamífero (Wang y col., Virol. 171: 275-279 (1989); Rajakumar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4154-4158 (1990)). Los cambios en la HA durante la selección y fabricación de vacunas de la gripe puede dar como resultado una mezcla de subpoblaciones antigénicamente distintas del virus. Los virus de la vacuna pueden, por lo tanto, diferir de las variantes presentes en las cepas epidémicas, dando como resultado niveles de protección no óptimos. En personas que tengan una alergia grave al huevo se pueden producir reacciones inmediatas de hipersensibilidad debido a la presencia de proteína de huevo residual en la vacuna. La vacuna contra la gripe porcina de 1976 se asoció a un aumento de la frecuencia del síndrome de Guillain-Barré. De momento, no se ha observado que las vacunas posteriores preparadas a partir de otras cepas de gripe hayan aumentado la probabilidad... [Seguir leyendo]

1.- Un método para fabricar la proteína de fusión de hemaglutinina, método que comprende infectar células de insecto cultivadas con un vector que contiene las siguientes secuencias en orden 5 -> 3: un promotor de polihedro procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, una secuencia que codifica para un péptido señal de quitinasa, la secuencia que codifica para hemaglutinina procedente de una cepa de gripe A y una cepa de gripe B, una secuencia que codifica para la segunda proteína, un codón de terminación de la traducción, y una señal de poliadenilación de ARN de polihedro; y cultivar las células en un medio nutriente, en el que el péptido señal de quitinasa comprende los aminoácidos TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA, o la secuencia que codifica el péptido señal de quitinasa comprende los nucleótidos TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG. 2.- El método de la reivindicación 1 que además comprende aislar la proteína de fusión de hemaglutinina de gripe a partir de células con una pureza de al menos 95%. 3.- El método de la reivindicación 2, en el que se aísla una proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura separando las proteínas ligadas a la membrana, que incluyen la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura procedente de proteínas que no son de membrana a pH alcalino, lavar las proteínas ligadas a membrana para eluir la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura, separar la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura eluída mediante una resina de intercambio aniónico con un cambio del pH, y separar la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura pasada por intercambio aniónico mediante una resina de intercambio catiónico con un cambio en la concentración salina. 4.- Un método para fabricar un vector que contiene las siguientes secuencias 5 -> 3: un promotor de polihedrina procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, una secuencia que codifica para un péptido señal de quitinasa, las secuencias codificadoras procedentes de hemaglutinina de una cepa de gripe seleccionada del grupo que consiste en cepas de gripe A y en cepas de gripe B, un codón de terminación de la traducción, y una señal de poliadenilación de ARN de polihedro; que comprende recolectar el virus del medio celular y aislar el ARN vírico, para las cepas de gripe A, o el ARNm vírico, para las cepas de gripe B; sintetizar ADNc usando un cebador universal (5 AGCAAAAGCAGG-3 (SEC ID Nº: 1)) para el ARN vírico de las cepas de gripe A o cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de gripe B, en donde los cebadores 5 y 3 presentan sitios de enzimas de restricción en los extremos que no se dan en los genes de hemaglutinina; amplificar los cebadores de gripe A ó B y el ADNc de gripe mezclado con los segmentos de gen de hemaglutinina para producir fragmentos de ADN de cadena doble que contengan secuencias codificadoras de hemaglutinina madura completa; identificar el péptido señal de los genes de hemaglutinina y entonces amplificar los genes de hemaglutinina menos el péptido señal; y clonar los genes de hemaglutinina menos el péptido señal en un vector que contiene el promotor de polihedro de AcNPV y la secuencia que codifica para el péptido señal de quitinasa, comprendiendo el péptido señal de quitinasa los aminoácidos TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA o la secuencia codificadora de péptido señal de quitinasa comprende los nucleótidos TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG. 5.- El método de la reivindicación 4, en el que los genes de hemaglutinina son clonados en el vector usando PCR de tal modo que el vector codifica el péptido señal acoplado directamente a la hemaglutinina sin ningún aminoácido interviniente. 6.- El método de la reivindicación 4, que además comprende transfectar el vector en células de insecto, y seleccionar células para la expresión de hemaglutinina. 7.- Una proteína de fusión de hemaglutinina de gripe recombinante expresada en un sistema de expresión de baculovirus cultivada en células de insecto obtenible mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y purificada hasta al menos el 95%. 8.- Una composición de vacuna que comprende la proteína de fusión de hemaglutinina de gripe recombinante de acuerdo con la reivindicación 7. 9.- La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la segunda proteína se selecciona del grupo que consiste en una proteína vírica de hepatitis B, una proteína de VIH, un antígeno carcinoembriónico y una neuraminidasa. 10.- La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la cepa de gripe infecta a humanos. 11.- La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende (i) un vehículo farmacéuticamente aceptable, o (ii) un adyuvante, o (iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante. 61   12.- La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un sistema de administración polimérico. 62   63   64     66   67