SÍNTESIS DE PÉPTIDOS SIMILARES A GLUCAGÓN.

Un método para fabricar un péptido GLP-1 o agonista de GLP-1 de fórmula **Fórmula** o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe- Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B o de fórmula **Fórmula** en las que B = -OH o -NH2 A = H-,

Ac-, Boc-, Fmoc R1 = His, D-His, desaminohistidina, 2-aminohistidina, ß-hidroxihistidina, homohistidina, α-fluorometilhistidina o αmetilhistidina R2 = Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly o Aib (ácido α-aminoisobutírico) R3 = Glu, Asp, Met o Leu, preferiblemente es Glu o Asp, lo más preferiblemente es Asp R4 = Lys o Arg R5 = Gly, Aib, Ala o D-Ala R6 = Arg, Lys o Gly R7 = Arg, Lys o Gly, preferiblemente Lys o Gly R8 = Gly o Aib y en las que, independientemente, x, y, w, z son 0 o 1, con la condición de que y sea 1 si x es 1 y con la condición de que w sea 1 sea z = 1, y en donde los aminoácidos individuales pueden tener opcionalmente grupos protectores, que comprende las etapas de a. sintetizar el péptido sobre una fase sólida, que es escindible bajo condiciones débilmente ácidas, mediante el acoplamiento por etapas de aminoácidos o dipéptidos, que comprenden dipéptidos de pseudoprolina, protegidos por Fmoc, adecuadamente protegidos adicionalmente en las cadenas laterales, de un modo lineal, en donde en una posición de secuencia adecuada un primer dipéptido de pseudoprolina seleccionado del grupo que consiste en Fmoc-Val-Ser(Ψ Me,Me pro)-OH, Fmoc-Val-Ser(Ψ H,H pro)-OH, Fmoc-Ser(P)- Ser(Ψ Me,Me pro)-OH y Fmoc-Ser(P)-Ser(Ψ H,H pro)-OH, en donde P es un grupo protector escindible con ácido que se escinde bajo una condición fuertemente ácida de al menos 80% de TFA, preferiblemente P es terc- butilo o es tritilo, se acopla a la cadena peptídica creciente, y en donde el grupo o los grupos protectores de cadenas laterales son escindibles bajo condiciones fuertemente ácidas, b. escindir el péptido de la fase sólida bajo condiciones débilmente ácidas y c. desproteger la cadena peptídica bajo condiciones fuertemente ácidas

La presente invención se refiere al campo de la síntesis de fármacos peptídicos, a saber a un nuevo método para sintetizar agonistas de péptido GLP-1. Una nueva clase de fármacos diabéticos, los agonistas de GLP-1 o péptido similar a glucagón 1, son una prometedora nueva clase de compuestos terapéuticos. Sin embargo, su preparación mediante técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida no es del todo fácil. Básicamente, el GLP-1 humano es un péptido presente en la naturaleza relacionado en secuencia con el glucagón. Se han descrito en la bibliografía diversas variantes de secuencia manipuladas ligeramente modificadas de GLP-1 natural, con el objetivo de incrementar la potencia. La preparación de tales péptidos GLP-1 se ha descrito en WO 05/027978, EP 1 180 121 y WO 02/90388; sin embargo, no se ha empleado para la síntesis de péptidos una metodología en fase sólida de Fmoc estándar mejor que la muy básica.

El solicitante de la presente invención encontró que el sistema de la técnica anterior no permitía buenos rendimientos, lo que es inaceptable para la fabricación industrial. Se encontró que las etapas de acoplamiento individuales aparentemente dependientes de la secuencia eran muy ineficaces.

El objetivo de la presente invención es idear otro método o uno mejorado para sintetizar agonistas de péptido GLP-1. Este objetivo se resuelve mediante el método de la presente invención que comprende el uso de una unidad de Fmoc-dipéptido de pseudoprolina en lugar de sólo Fmoc-aminoácidos individuales en una posición de secuencia interna única durante la síntesis en fase sólida. De acuerdo con la presente invención, se idea un método para fabricar un péptido GLP-1 o agonista de GLP-1, en el que dicho péptido es de fórmula

**(Ver fórmula)**

o es de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B o es de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B

o es de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B

o es de fórmula

o es de fórmula

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

en las que B = -OH o -NH2

A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc

R1 = His, D-His, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homohistidina, alfa-fluorometil-histidina o alfa-metil-histidina

5 R2 = -Ala, D-Ala, -Val, D-Val, Gly, Aib (ácido α-aminoisobutírico)

R3 = Glu, Asp, Met, Leu, preferiblemente es Glu o Asp, lo más preferiblemente es Asp

R4 = -Lys oArg

R5 = -Gly, Aib, Ala, D-Ala

R6 = Arg,Lys o Gly R7 = Arg, Lys o Gly, preferiblemente Lys o Gly

R8 = Gly o Aib

y en las que, independientemente, x, y, w, z son 0 o 1, con la condición de que y = 1 cuando x = 1 y con la condición de que w= 1 cuandoz = 1,

en donde los aminoácidos individuales pueden tener opcionalmente grupos de protección, que comprende las etapas de

a. sintetizar el péptido sobre una fase sólida que es escindible bajo condiciones débilmente ácidas mediante el acoplamiento por etapas de aminoácidos o dipéptidos que comprenden dipéptidos de pseudoprolina protegidos por Fmoc, adecuadamente protegidos adicionalmente en las cadenas laterales, de un modo lineal, con la condición de que en una posición de secuencia adecuada que se lee -Val-Ser-y/o Val-Ser-Ser, 20 respectivamente, y está marcada mediante letras en negrita en las fórmulas de secuencia dadas anteriormente, un primer dipéptido de pseudoprolina se acople a la cadena peptídica creciente cuyo dipéptido de pseudoprolina se selecciona del grupo que consiste en Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)-OH, Fmoc-ValSer(ψH,Hpro)-OH, Fmoc-Ser(P)-Ser(ψMe,Mepro)-OH y Fmoc-Ser(P)-Ser(ψH,Hpro)-OH, y en donde P es un grupo de protección de cadenas laterales escindible con ácido que se escinde bajo una condición fuertemente ácida

25 de al menos 80% de TFA en agua, lo más preferiblemente P es terc-butilo o es tritilo,

b. escindir el péptido de la fase sólida bajo condiciones débilmente ácidas y

c. desproteger la cadena peptídica bajo condiciones fuertemente ácidas.

La actividad de los péptidos GLP-1 es altamente sensible a cambios en la secuencia, principalmente los elementos de secuencia periféricos que permiten alguna sustitución conservativa de residuos. Cambios aparentemente menores puede tener todavía efectos imprevistos sobre la estabilidad biológica o la unión al receptor y de ahí la actividad farmacológica. Una buena revisión de esto se da en Sarrauste de Menthière et ál., European J. Medicinal Chemistry 39, 2004:473-480. La porción de secuencia nuclear de la familia de péptidos GLP-1 literalmente no permite ningún cambio.

La síntesis lineal en fase sólida de péptidos de longitud completa o parciales que comprenden esta porción nuclear encuentra enormes problemas de etapas de acoplamiento individuales que son completamente ineficaces hasta el punto de casi la imposibilidad incluso durante el acoplamiento repetido. Prolongar los tiempos de acoplamiento, elevar la temperatura de acoplamiento, etc. implica riego de racemización o productos secundarios no deseados incrementados.

Diversos autores (Sarrauste, anteriormente, y Adelhorst et ál. J. Biol. Chem. 269 (1994), 6275-6278) han analizado

40 la estructura secundaria de péptidos GLP-1 naturales en solución acuosa mediante espectroscopía de dicroismo circular (p. ej., Chen et ál.. (1974) Determination of the helix and beta form of proteins in aqueous solution by circular dichroism. Biochemistry 13, 3350-3359, Greenfield, N. y Fasman, G. D. (1969) Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 8, 4108-4116) y han encontrado sólo un contenido bastante bajo (10%) de estructura de lámina β que provoca la agregación de cadenas principales peptídicas, sin embargo,

45 aparte de regiones mucho mayores de estructura desordenada y helicoidal. Los métodos espectroscópicos

40

45

aplicados no permitían asignar las correspondientes partes de la secuencia de GLP-1 a dichos elementos estructurales. – Se cree comúnmente en la técnica que la agregación y de ahí los problemas en la síntesis en fase sólida se correlacionan con la presencia de regiones extendidas de estructura de lámina β. Un bajo contenido de estructura de lámina β es común a la mayoría de los péptidos de al menos 10 aa de longitud y no se correlaciona con ningún problema inusual en la metodología sintética.

Unidades Fmoc-dipéptido de pseudoprolina están disponibles comercialmente hoy en día; su síntesis se ha descrito (Ruckle et ál., Tetrahedron 1999, 55(37): 11281-11288; Keller et ál., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120:2714-2720, pongamos por caso). Dichos péptidos de pseudoprolina se usan al menos para introducir al menos uno de los residuos de Serina centrales en el segmento de secuencia o posición de secuencia o secuencia parcial central único -Val-Ser-Ser-, permitiendo usar dipéptidos de pseudoprolina para la secuencia parcial bien -Val-Ser-o bien -Ser-Seren esta posición de secuencia, siendo esto lo esencial de la presente invención, y además de eso finalmente introducir adicionalmente un segundo residuo de pseudoprolina en las secuencias parciales -Gly-Thr-o -Phe-Thr-, preferiblemente en la secuencia parcial -Gly-Thr-. Dichas pseudoprolinas de la presente invención son carboxilatos de N-Fmoc-peptidil-(4S)-1,3-oxazolidina derivados de Ser o Thr y que tienen en el contexto de la presente invención la estructura común de fórmula I

**(Ver fórmula)**

en la que K es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Val, Phe, Gly y en la que Ser tiene además un grupo de protección de la cadena lateral P que es escindible bajo condiciones fuertemente ácidas según se definen anteriormente; R11, R12, independientemente, son H, metilo o etilo y R10 es H o metilo. – La naturaleza de los sustituyentes R11 y R12 influye en la isomerización cis/trans del enlace amida del péptido del que es parte la oxazolidina y de ahí el impacto de la pseudoprolina de afectar positivamente a la estructura de la cadena peptídica creciente durante la síntesis.

Más preferiblemente, sólo dicho primer un residuo de pseudoprolina en uno cualquiera de los dos sitios de residuos de Ser centrales dentro de la secuencia de GLP-1 que se especifica anteriormente se emplea en el presente... [Seguir leyendo]

1. Un método para fabricar un péptido GLP-1 o agonista de GLP-1 de fórmula

**(Ver fórmula)**

5 o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B

o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B

o de fórmula 10 A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B

o de fórmula

o de fórmula

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

15 en las que

B = -OH o -NH2

A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc

R1 = His, D-His, desaminohistidina, 2-aminohistidina, β-hidroxihistidina, homohistidina, α-fluorometilhistidina o α

metilhistidina 20 R2 = Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly o Aib (ácido α-aminoisobutírico)

R3 = Glu, Asp, Met o Leu, preferiblemente es Glu o Asp, lo más preferiblemente es Asp

R4 = Lys oArg

R5 = Gly, Aib, Ala o D-Ala

R6 = Arg,Lys o Gly 25 R7 = Arg, Lys o Gly, preferiblemente Lys o Gly

R8 = Gly o Aib

y en las que, independientemente, x, y, w, z son 0 o 1, con la condición de que y sea 1 si x es 1 y con la condición de que w sea 1 sea z = 1, y en donde los aminoácidos individuales pueden tener opcionalmente grupos protectores,

que comprende las etapas de

a. sintetizar el péptido sobre una fase sólida, que es escindible bajo condiciones débilmente ácidas, mediante el acoplamiento por etapas de aminoácidos o dipéptidos, que comprenden dipéptidos de pseudoprolina, 5 protegidos por Fmoc, adecuadamente protegidos adicionalmente en las cadenas laterales, de un modo lineal, en donde en una posición de secuencia adecuada un primer dipéptido de pseudoprolina seleccionado del grupo que consiste en Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)-OH, Fmoc-Val-Ser(ψH,Hpro)-OH, Fmoc-Ser(P)Ser(ψMe,Mepro)-OH y Fmoc-Ser(P)-Ser(ψH,Hpro)-OH, en donde P es un grupo protector escindible con ácido que se escinde bajo una condición fuertemente ácida de al menos 80% de TFA, preferiblemente P es terc

10 butilo o es tritilo,

se acopla a la cadena peptídica creciente,

y en donde el grupo o los grupos protectores de cadenas laterales son escindibles bajo condiciones fuertemente ácidas,

b. escindir el péptido de la fase sólida bajo condiciones débilmente ácidas y

15 c. desproteger la cadena peptídica bajo condiciones fuertemente ácidas.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un residuo de glicidilo que puede acoplarse como residuo de Fmoc-glicidilo o como un residuo de Fmoc-aminoacilglicidilo está adicionalmente protegido en N en su Nα de la cadena principal con N-(o,p-dialcoxi-bencilo) o con N-(o-hidroxi-p-alcoxi-bencilo) o con N-(o-aciloxi-p-alcoxi-bencilo), siendo el aciloxi y el alcoxi, independientemente, alcoxi C1-C4 y aciloxi C1-C4, respectivamente, con la condición de que dicho residuo de glicidilo no esté comprendido en una secuencia -GlyThr(ψMe,Mepro)-o -Gly-Thr(ψH,Hpro)-y esté separado al menos por dos residuos de aminoácido intermedios de otro residuo de pseudoprolina o glicidilo protegido en Nα.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se usan dos dipéptidos de pseudoprolina, en

donde el segundo está separado por al menos cuatro residuos de aminoácido intermedios del mencionado primero y 25 preferiblemente es Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Mepro)-OH.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque sólo se usa en la síntesis un dipéptido de pseudoprolina, preferiblemente Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)-OH.

5. Un péptido GLP-1 o agonista de GLP-1 conjugado a una fase sólida, de fórmula

**(Ver fórmula)**

30 o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-S

o de fórmula A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-S

o de fórmula 35 A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-S

o de fórmula

**(Ver fórmula)**

o de fórmula

**(Ver fórmula)**

en las que S = fase sólida, que es escindible bajo condiciones débilmente ácidas y que está unida covalentemente con el

extremo C del resto peptidílico a través de un grupo tioéster, éster o amido o, si el aminoácido C-terminal es una lisina, de forma opcional covalentemente a través de la función amino en ε de dicha lisina, A = H, Ac, Boc o Fmoc R1 = His, D-His, desaminohistidina, 2-aminohistidina, β-hidroxihistidina, homohistidina, α-fluorometilhistidina o α

metilhistidina R2 = Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly o Aib (ácido α-aminoisobutírico) R3 = Glu, Asp, Met o Leu, preferiblemente es Glu o Asp, lo más preferiblemente es Asp R4 = Lys oArg R5 = Gly, Aib, Ala o D-Ala R6 = Arg,Lys o Gly R7 = Arg, Lys o Gly, preferiblemente Lys o Gly R8 = Gly o Aib y en donde, independientemente, x, y, w, z son 0 o 1, con la condición de que y sea 1 si x es 1 y con la condición de

que w sea 1 si z es 1, en donde cadenas laterales individuales de al menos Lys, Thr, Ser, Glu, Asp tienen grupos protectores, que son escindibles bajo condiciones fuertemente ácidas y grupos protectores que pueden ser grupos protectores pseudoprolina en el caso de Thr o Ser, y en donde una Ser en el segmento de secuencia único -Val-SerSer-es un derivado pseudoprolínico de serina, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en -Ser(ψMe,Mepro)-y -Ser(ψH,Hpro)-.

6. Un péptido conjugado a una fase sólida de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha Serpseudoprolina es el único residuo protegido por pseudoprolina en el péptido.

7. Un péptido conjugado a una fase sólida de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el péptido comprende al menos un residuo protegido por pseudoprolina adicional que es -Thr(ψMe,Mepro)-o -Thr(ψH,Hpro)-y está situado en el segmento de secuencia único -Gly-Thr-, preferiblemente el péptido comprende sólo dos residuos protegidos por pseudoprolina que son dichos residuos de pseudoprolina primero y uno adicional.