Dispositivo para separar y/o detectar varias dianas moleculares disueltas en una mezcla compleja,

dicho dispositivo comprendiendo una red de capilares (D) que permiten la circulación de la mezcla compleja introducida dentro del dispositivo, que se caracteriza porque comprende, por otra parte, dos juegos de electrodos (B, G) dispuestos a uno y otro lado de la red de capilares: - un juego de electrodos funcionalizados (B), cuyos electrodos están anclados con sondas organizadas en puntos de hibridación dentro de los capilares, cada sonda siendo susceptible de retener una diana molecular específica presente en la mezcla compleja mediante unión específica sonda/diana; - un juego de electrodos no funcionalizados (G), y porque los capilares (D) están unidos en uno de sus extremos a un depósito (F) que consta de un electrodo circular (C) situado en el mismo plano que el del juego de electrodos funcionalizados, un electrodo de unión (A) estando situado, por otra parte, entre el electrodo circular y el primer electrodo funcionalizado, de tal modo que las distancias más cortas entre el electrodo de unión y el electrodo circular sean idénticas en cualquier punto de los electrodos

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a un dispositivo para separar y/o analizar varias dianas moleculares disueltas en una mezcla compleja, en particular ácidos nucleicos o proteínas. La invención se refiere en concreto a un dispositivo que comprende un chip o matriz organizada de sondas de biopolímeros, para la separación o el análisis de dianas moleculares. Un dispositivo de este tipo separa y/o detecta varias dianas moleculares disueltas en una mezcla compleja. De acuerdo con un primer modo de realización la invención comprende un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1.

La invención también se refiere a los usos de un dispositivo de este tipo, en particular para la separación y/o el análisis de moléculas de ADN o de ARN contenidas en una muestra biológica.

Se sabe determinar la masa de las macromoléculas como el ADN, el ARN o las proteínas, a partir de un análisis de espectometría de masa. Si el análisis mediante este procedimiento se acompaña de una descomposición controlada de las moléculas, también se puede determinar su secuencia. No obstante, para las mezclas de moléculas de tamaños y secuencias diferentes, mediante esta técnica resulta difícil e incluso imposible discriminar entre las diferentes moléculas.

De forma alternativa a la detección mediante espectrometría de masa, se pueden utilizar otros métodos.

De este modo, la resonancia de plasmones superficiales (SPR) permite determinar la densidad de materia acumulada a una pequeña distancia (menos de 200 nm) de la superficie de una lámina de bajo espesor (x nm) de metal con electrón libre como el oro o el platino… En efecto, la reflexión sobre una de las caras de la lámina de metal se modifica de forma proporcional a la densidad y a la cantidad de materia que se encuentra cerca de la otra cara. No obstante, realmente no es posible distinguir entre los diferentes tipos de moléculas que contribuyen a la modificación de la reflexión. Por otra parte, mediante este método, la sensibilidad de detección de la fijación de las dianas sobre los biochips es inferior, por el momento, a la sensibilidad que se alcanza en fluorescencia con moléculas marcadas. La presencia misma de las sondas sobre la superficie del metal disminuye la sensibilidad de detección alejando las dianas del metal. Durante las mediciones dinámicas de la interacción diana/sonda, la presencia de las moléculas diana libres cerca de la superficie falsea la medición. La detección mediante los métodos de SPR necesita, por lo general, para resultar eficaz una cantidad mayor de materiales de la que necesitarían los métodos de marcados fluorescentes o radioactivos. Por esta razón la detección mediante SPR es todavía incompatible con un cierto número de experimentos, en particular en el campo de la diagnosis.

Por otra parte, se puede recurrir a la medición de la variación de impedancia que existe entre diferentes estados de moléculas.

Una molécula de ADN de cadena simple de una secuencia dada no tiene la misma impedancia que el complejo emparejado de doble cadena correspondiente. Esta propiedad se utiliza en los chips de ADN para evaluar la proporción de hibridación y, por lo tanto, el número de complejos sonda-diana formados en un biochip (ref.). De una manera general, las variaciones de impedancia se pueden utilizar para estudiar las interacciones intermoleculares como la fijación de un ligando sobre su receptor, pero también las interacciones entre moléculas de ADN o de proteínas con una droga, un ión… No obstante, para los biochips, este método de detección se ve limitado:

1) Por la dificultad de realizar chips de altas densidades, de más de 2.000 puntos de hibridación. En efecto,

debido al tamaño de los electrodos y a la geometría de los elementos de conexión que se utilizan para

realizar los chips de impedancia, la superficie de hibridación resulta muy grande en cuanto el número de

puntos de hibridación supera los 800. Ahora bien, una gran superficie de hibridación implica un gran

volumen de la muestra que debe cubrir la superficie de hibridación, de ahí la necesidad de una gran

cantidad de material biológico para alcanzar la concentración mínima para la detección. Esto es

incompatible con los experimentos en los que se dispone de poco material, como es el caso de los

diagnósticos.

2) Por los cambios de conformación de las moléculas que se estudian (sonda y/o diana) que implican unos

aparatos de medición que hacen que no se puedan interpretar las variaciones de impedancia medidas. Por

ejemplo, las deformaciones del ADN debidas a la secuencia o las hibridaciones intramoleculares provocan

unas variaciones de impedancia del mismo orden de importancia que en el caso de la hibridación.

En la técnica anterior se utilizan transistores de efecto de campo como amplificadores de corriente para medir la variación de impedancia ligada a la hibridación de la molécula de ADN (ref.). El anclado de las sondas se realiza al nivel de la rejilla del transistor. Cuando las dianas se fijan, estas modifican la impedancia de la rejilla lo que implica una modificación de la corriente entre la fuente (entrada del transistor) y el drenaje de salida del transistor. Sin embargo, no se ha descrito ninguna organización en red para este tipo de detector. El hecho de utilizar el transistor de efecto de campo como amplificador de corriente limita la frecuencia de las corrientes alternativas que se pueden utilizar para resaltar las variaciones de impedancia ligadas a la hibridación, que limita por lo tanto la sensibilidad del detector (ref.). Además, en las descripciones anteriores, la rejilla controla el paso de la corriente dentro del transistor, y el hecho de anclar las sondas en su interior elimina la posibilidad de utilizar los diferentes bornes del transistor como electrodos para controlar el movimiento de las dianas y, por lo tanto, para dirigir la hibridación concentrando las dianas al nivel de las sondas.

Las matrices organizadas de sondas de biopolímeros (chips de ADN, chips de proteínas, etc.) permiten separar de manera cualitativa y cuantitativa los biopolímeros que están presentes en una mezcla y esto, en teoría, sean cuales sean su número, sus secuencias y sus composiciones. Sin embargo, las redes de ácidos nucleicos, por ejemplo, no permiten contar de manera total y precisa el número de moléculas hibridadas. Por otra parte, con la tecnología de la que se dispone en la actualidad, la detección de los biopolímeros en chips (« micro-arrays ») es indirecta, necesitando de una etapa de marcado de estos (fluorescencia, radioactividad…). Si los rendimientos de incorporación de residuos radiomarcados y de residuos fríos en los biopolímeros son prácticamente los mismos, no sucede lo mismo con los marcadores fluorescentes (Martínez y otros – Nucl. Acids. Res. 2003 31: p. 18; Hoen y otros – Nucleid Acids Res. 2003 Mar 1; 31 (5); p. 20). Los inconvenientes de los marcados se encuentran en particular en el caso de la síntesis de las moléculas de ADNc que incorporan los marcadores fluorescentes CY3 y CY5. El amontonamiento estérico que se deriva de este último tipo de marcado puede, por otra parte, modificar de forma importante las cinéticas y los equilibrios estequiométricos de las reacciones (hibridación, reacción anticuerposantígenos, reacción diana-ligando en general…). Los inconvenientes de los amontonamientos estéricos se eliminan por medio del empleo de isótopos radioactivos; no obstante, los isótopos radioactivos implican una gestión de los desechos radioactivos. Por otra parte, las tecnologías de detección de moléculas marcadas de forma radioactiva, es decir, esencialmente de tipo phosphorimager para la radioactividad (Bertucci, F. y otros – Hum Mol Genet. 1999 Sep; 8 (9): 1715-22. Fe de erratas en: Hum Mol Genet 1999 Oct; 8 (11); p. 2129) y los diferentes tipos de escáner para la detección de la fluorescencia presentan un cierto número de límites en cuanto a la cantidad de material biológico que hay que hibridar en un chip para alcanzar los umbrales de detección y de reproducibilidad de las mediciones realizadas. De hecho, no es posible detectar las moléculas presentes en algunas copias por célula a partir de muestras que presentan un reducido número de células (~ 1.000 células), lo que corresponde sin embargo a una situación frecuente en el caso de los muestreos clínicos.

Una alternativa... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para separar y/o detectar varias dianas moleculares disueltas en una mezcla compleja, dicho dispositivo comprendiendo una red de capilares (D) que permiten la circulación de la mezcla compleja introducida dentro del dispositivo, que se caracteriza porque comprende, por otra parte, dos juegos de electrodos (B, G) dispuestos a uno y otro lado de la red de capilares:

− un juego de electrodos funcionalizados (B), cuyos electrodos están anclados con sondas organizadas en puntos de hibridación dentro de los capilares, cada sonda siendo susceptible de retener una diana molecular específica presente en la mezcla compleja mediante unión específica sonda/diana;

− un juego de electrodos no funcionalizados (G),

y porque los capilares (D) están unidos en uno de sus extremos a un depósito (F) que consta de un electrodo circular (C) situado en el mismo plano que el del juego de electrodos funcionalizados, un electrodo de unión (A) estando situado, por otra parte, entre el electrodo circular y el primer electrodo funcionalizado, de tal modo que las distancias más cortas entre el electrodo de unión y el electrodo circular sean idénticas en cualquier punto de los electrodos.

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el juego de electrodos funcionalizados

(B) está situado por encima de la red de capilares (D) y porque el juego de electrodos no funcionalizados (G) está situado por debajo de la red de capilares.

3. Dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, que se caracteriza porque los capilares (D) están unidos en el otro de sus extremos a otro depósito (F).

4. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 3, que se caracteriza porque el otro depósito (F) consta de un electrodo circular (C).

5. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4, que se caracteriza porque el electrodo circular (C) del otro depósito (F) está situado en el mismo plano que el del juego de electrodos funcionalizados (B).

6. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que se caracteriza porque consta de otro electrodo de unión

(A) situado entre el electrodo circular (C) del otro depósito (F) y el último electrodo funcionalizado (B), de tal modo que la distancia entre el electrodo de unión (A) y el electrodo circular (C) sea idéntica en cualquier punto de los electrodos.

7. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque los electrodos de unión (A) son curvos.

8. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se caracteriza porque los capilares (D) están unidos en el otro de sus extremos a un canal transversal (W).

9. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 8, que se caracteriza porque el canal transversal (W) está asociado a un electrodo rectilíneo (V) de unión que sirve de frontera eléctrica infranqueable por las sondas durante la hibridación y que permite dirigir las dianas hacia un sistema de retardo de migración por medio de los potenciales que establecen los electrodos del dispositivo.

10. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque el juego de electrodos funcionalizados (B) comprende unos electrodos de línea funcionalizados que son paralelos entre sí, y el juego de electrodos no funcionalizados (G) comprende unos electrodos de línea no funcionalizados que son paralelos entre sí.

11. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 10, que se caracteriza porque los electrodos de línea funcionalizados (B) son paralelos a los electrodos de línea no funcionalizados (G).

12. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 10, que se caracteriza porque los electrodos de línea funcionalizados (B) son perpendiculares a los electrodos de línea no funcionalizados (G).

13. Dispositivo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque el juego de electrodos funcionalizados (B) o no funcionalizados (G) comprende unos primeros electrodos de línea paralelos (M) y unos segundos electrodos de línea paralelos (N) que están superpuestos y son perpendiculares a los primeros electrodos de línea paralelos de tal modo que forman una cuadrícula de electrodos en un mismo plano.

14. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 13, que se caracteriza porque cada malla de la cuadrícula delimita un espacio en el que están dispuestos un electrodo de punto de hibridación (O) y uno o dos transistores de efecto de campo, cada transistor teniendo su rejilla (P) conectada a uno de los primeros electrodos, en un lado de la malla, su borne entrante (Q) conectado a uno de los segundos electrodos, en otro lado de la malla, y su borne saliente (R)

conectado al electrodo de punto de hibridación.

15. Utilización del dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la detección y/o la dosificación de moléculas de ARN y/o de ADN específicas contenidas en una muestra biológica, en particular un

5 extracto circular, en la que las sondas moleculares se seleccionan de tal modo que se hibridan de forma específica con un tipo de ARN o ADN contenido en la muestra biológica.

16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, para el análisis comparativo de moléculas de ARN y/o de ADN

específicas contenidas en dos muestras biológicas. 10

17. Procedimiento de separación y/o de dosificación de dianas moleculares contenidas en una mezcla compleja, dicho procedimiento comprendiendo:

1. la introducción de una mezcla compleja que contiene dianas moleculares que hay que separar dentro de un 15 dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;

2. la aplicación de un potencial eléctrico entre los electrodos del dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, de tal modo que las dianas puedan migrar desde un extremo de la red de capilares hasta el otro y que las dianas complementarias de las sondas se puedan hibridar;

3. el análisis in situ o la recuperación y el análisis de cada diana hibridada con una sonda por medio de un 20 detector.