MICROCHIPS DE ELECTROFORESIS CAPILAR DE RESINA EPON SU-8 CON DETECCION ELECTROQUIMICA INTEGRADA.

Microchips de electroforesis capilar de resina EPON SU-8 con detección electroquímica integrada,

preferentemente amperométrica, totalmente integrada en el microchip. La detección electroquímica se obtiene tanto con electrodos convencionales como con uno o varios microelectrodos en disposición array o interdigitados que permiten adaptar la detección al tipo de análisis que se requieran. También es objeto de la presente invención una metodología para la inyección de la muestra de forma simultánea y reproducible en dichos mlcrochips. Además, es objeto de la presente invención el uso de dicho microchip para la separación, detección, identificación y cuantificación de varios compuestos químicos y bioquímicos. De aplicación en los sectores de análisis clínico, medioambiental o agroalimentario

Microchips de electroforesis capilar de resina EPON SU-8 con detección electroquímica integrada.

Es objeto de la presente invención un microchip de electroforesis capilar de resina EPON SU-8 (desde ahora simplemente SU-8) que integra un sistema de detección electroquímico, preferentemente amperométrico; también es objeto de la presente invención una metodología para la inyección de la muestra de forma simultánea y reproducible en dichos microchips. Además, es objeto de la presente invención el uso de dicho microchip para la separación, detección, identificación y cuantificación de varios compuestos químicos y bioquímicos.

La invención resulta de aplicación en la separación, detección, identificación y cuantificación de sustancias químicas y bioquímicas principalmente en los sectores de análisis clínico, medioambiental o agroalimentario.

Estado de la técnica

La detección electroquímica (ED) resulta una herramienta muy adecuada por su facilidad de miniaturización e integración, alta sensibilidad, selectividad, sencillez y bajo coste (J. Wang, Analytical Electrochemistry, Wiley-VHC, New York, 2006).

Por otra parte, una de las tendencias actuales en gran variedad de campos de la ciencia es la miniaturización de los sistemas analíticos y bioanalíticos, lo cual ha dado lugar a la aparición de los llamados Lab-on-a-Chip (LOC) o microsistemas de análisis total (µTAS) (P.S. Dittrich, K. Tachikawa, A. Manz, Anal. Chem. 2006, 78, 3887).

Así, los sistemas de análisis total (µTAS), especialmente microchips de electroforesis capilar (MCE), se han beneficiado de las ventajosas características de la detección electroquímica desde que ésta fue introducida en los microchips de electroforesis capilar (P.F. Gavin, A.G. Ewing, Anal. Chem. 1997, 69, 3838; A.T. Woolley, K. Lao, A.N. Glazer, R.A. Mathies, Anal. Chem. 1998, 70, 684). A diferencia de los métodos ópticos, como la fluorescencia (LIF), los sistemas electroquímicos son fácilmente miniaturizables y no requieren complicados componentes ópticos, haciendo el sistema mucho más portable.

El diseño de la celda electroquímica es uno de los puntos clave para el correcto funcionamiento de los microchip de electroforesis capilar con el sistema de detección. Así, se han descrito diferentes configuraciones para la integración y aislamiento del sistema de detección electroquímico en los microchips: dentro del canal, fuera del canal y a la salida del canal (W.R. Vandaveer IV, S.A. Pasas-Farmer, D.J. Fischer, C.N. Frankenfeld, S.M. Lunte, Electrophoresis 2004, 25, 3528).

En las configuraciones dentro y fuera del canal, el electrodo de trabajo se encuentra situado dentro del canal de separación sin o con un desacoplador, respectivamente. En estos casos, los electrodos se basan en películas metálicas (oro, platino, paladio u óxido de indio y estaño - ITO) o de carbono, integradas en microchips generalmente de vidrio y polímero tal como el polidimetilsiloxano (PDMS) (R.S. Martin, K.L. Ratzlaff, B.H. Huyng, S.M. Lunte, Anal. Chem. 2002, 74, 1136; M. Castaño-Álvarez, M.T. Fernández-Abedul, A. Costa-García, Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 303; N.A. Lacher, S.M. Lunte, R.S. Martin, Anal. Chem. 2004, 76, 2482; J. Vickers, C.S. Henry, Electrophoresis 2005, 26, 4641; C. Chen, J.H. Hahn, Anal. Chem. 2007, 79, 7182; L.C. Meeker, R.S. Martin, Electrophoresis 2006, 27, 5032; A. Dawoud, T. Kawaguchi, R. Jankowiak, Anal. Bioanal. Chem. 2007, 388, 245).

La configuración a la salida del canal, en la cual el electrodo de trabajo se encuentra situado a unas pocas micras de la salida del canal de separación, ha sido la más empleada. Este tipo de configuración ha permitido alinear externamente diferentes tipos de electrodos como hilos o discos metálicos, fibras de carbono o películas de carbono empleando complicados sistemas de auto-posicionamiento (US 2007/0039822 A1; US 6.878.255 B1; J. Wang, B. Tian, E. Sahlin, Anal. Chem. 1999, 71, 5436; M.A. Schwarz, B. Galliker, K. Fluri, T. Kappes, P.C. Hauser, Analyst 2001, 126, 147; J.C. Fanguy, C.S. Henry, Electrophoresis 2002, 23, 767; N. Bao, J.-J. Xu, Y.-H. Dou, Y. Cai, H.-Y. Chen, X.-H. Xia, J. Chromatogr. A 2004, 1041, 245; M. Castaño-Álvarez, M.T. Fernández-Abedul, A. Costa García, Electrophoresis 2007, 28, 4679). Sin embargo, este tipo de electrodos no se encuentran totalmente integrados en el microchip y, por tanto, no aprovechan todas las ventajas de la inherente miniaturización de los sistemas de detección electroquímicos, requiriendo el empleo de elementos externos al propio microchip. Ademas, en muchos casos, el posicionamiento de los electrodos es irreproducible de modo que los resultados cambian de microchip a microchip. Así, también se ha empezado a integrar los electrodos en el microchip por medio de películas metálicas empleando técnicas de microfabricación, principalmente sobre sustratos de vidrio (PCT WO02/024322 A3; PCT WO03/06651 A2; US 5.906.723; US 6.045.676; R.P. Baldwin, T.J. Roussel, Jr., M.M. Crain, V. Bathlagunda, D.J. Jackson, J. Gullapalli, J.A. Conklin, R. Pai, J.F. Naber, K.M. Walsh, R.S. Keynton, Anal. Chem. 2002, 74, 3690; R. Wilke, S. Büttgenbach, Biosens. Bioelectron. 2003, 19, 149; A.A. Dawoud, T. Kawaguchi, Y. Markushin, M.D. Porter, R. Jankowiak, Sens. Actuat. B 2006, 120, 42 - 50).

Las técnicas de microfabricación también han permitido desarrollar diferentes detectores duales en los cuales se emplean dos electrodos de trabajo en serie (D.J. Fischer, W.R. Vandaveer IV, R.J. Grigsby, S.M. Lunte, Electroanalysis 2005, 17, 1153; R.S. Martin, A.J. Gawron, B.A. Fogarty, F.B. Regan, E. Dempsy, S.M. Lunte, Analyst 2001, 126, 277; R.S. Martin, A.J. Gawron, S.M. Lunte, C.S. Henry, Anal. Chem. 2000, 72, 3196; A.J. Gawron, R.S. Martin, S.M. Lunte, Electrophoresis 2001, 22, 242). La posibilidad de integrar un electrodo en el interior del canal de separación y alinear externamente otro electrodo para obtener un sistema dual hibrido dentro/fuera del canal también ha sido evaluado (M. Castaño-Álvarez, M.T. Fernández-Abedul, A. Costa-García, J. Chromatogr. A 2006, 1109, 291). También se han desarrollado microchips de vidrio con dos canales de separación paralelos en el que se emplean dos electrodos de trabajo en paralelo alineados externamente y que no se encuentran totalmente integrados en el propio microchip (D.F. Pozo Ayuso, M. Castaño-Álvarez, A. Fernández-la-Villa, M. García Granda, M.T. Fernández-Abedul, J. Rodríguez García, A. Costa-García, J. Chromatogr. A 2008, 1180, 193). Ademas, en estos casos se emplean electrodos de referencia y auxiliar externos que tampoco se encuentran integrados en el microchip. También se ha descrito un microchip de PDMS que consta de un canal de separación y otro canal de referencia paralelo, en los cuales se integra un electrodo de trabajo y referencia, respectivamente (C. Chen, J.H. Hahn, Anal. Chem. 2007, 79, 7182). La posibilidad de realizar ensayos paralelos también se ha evaluado empleando un microchip de policarbonato (PC) multicanal en combinación con un detector conductimétrico (H. Shadpour, M.L. Hupert, D. Patterson, C. Liu, M. Galloway, W. Stryjewski, J. Goettert, S.A. Soper, Anal. Chem. 2007, 79, 870).

La integración de la detección electroquímica se ha realizado principalmente en microchips fabricados en vidrio y materiales poliméricos como PMMA, PDMS o PC (A.J. Blasco, I. Barrigas, M.C. González, A. Escarpa, Electrophoresis 2005, 26, 4664; J. Wang, G. Chen, M. Pumera, Electroanalysis 2003, 15, 862; R.-H. Horng, P. Han, H.-Y. Chen, K.-W. Kuan-Wen Lin, T.-M. Tung-Mung Tsai, J. Micromech. Microeng. 2005, 15, 6; M. J. Schöning, M. Jacobs, A. Muck, D.-T. Knobbe, J. Wang, M. Chatrathi, S. Spillmann, Sens. Actuat. B 2005, 108, 688; J. Wang, M. Pumera, M. P. Chatrathi, A. Rodríguez, S. Spillman, R. S. Martin, S. M. Lunte, Electroanalysis 2002, 14, 1251; Y. Liu, D. Ganser, A. Schneider, R. Liu, P. Grodzinski, N. Kroutchinina, Anal. Chem. 2001, 73, 4196; M. Castaño-Álvarez, M.T. Fernández-Abedul, A. Costa- García, Electrophoresis 2005, 26, 3160).

La resina SU-8 es una foto-resina epoxi negativa que se caracteriza por su alta transparencia óptica, su facilidad para ser mecanizada, alta resistencia química y su carácter hidrofílico. Inicialmente este tipo de resina fue utilizada en procesos fotolitográficos como material perecedero para la fabricación de microchips y otros dispositivos en materiales de vidrio. Es decir, la resina SU-8 se empleaba como...

1. Microchip de electroforesis capilar de resina EPON SU-8 que comprende uno o varios canales de separación (1) en cuyos extremos opuestos se sitúa un depósito de disolución reguladora (A) y un depósito de detección (B), y uno o varios canales de inyección (2) con al menos un deposito de muestra (C) en uno de sus extremos, los cuales se cruzan en una zona de intersección (7) situada en la mitad superior del microchip caracterizado porque integra un sistema de detección electroquímico en los depósitos de detección (B) con al menos un electrodo de trabajo (WE) por cada canal de separación (1) compuesto de un array de microelectrodos (9), un electrodo de referencia (RE) y un electrodo auxiliar (AE); un electrodo de voltaje de separación (5) contenido en los depósitos de disolución reguladora (A); un electrodo de voltaje de inyección (6) contenido en cada depósito de muestra (C); y porque los electrodos son de metal o de tintas líquidas, incorporando los de metal una capa intermedia de cromo o titanio.

2. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque el metal es oro, platino, cobre, plata, níquel o paladio.

3. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque las tintas son de carbono, de oro, de platino o de plata.

4. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque los electrodos son integrados mediante técnicas fotolitográficas o de serigrafiado.

5. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque la capa intermedia de los electrodos tiene un espesor de entre 5 y 50 nm.

6. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque además comprende un electrodo de tierra (8) adicional contenido en los depósitos de detección (B).

7. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque el sistema de detección electroquímico es amperométrico.

8. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque los canales de separación (1) tienen una longitud entre 10 y 100 mm, los canales de inyección (2) tienen una longitud entre 1 y 20 mm y los depósitos (A, B y C) tienen una distancia entre los bordes que lo delimitan de 0.5 a 20 mm.

9. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque los canales tienen una anchura comprendida entre 10 y 150 µm y una profundidad entre 10 y 100 µm.

10. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque los electrodos tienen un espesor entre 100 nm y 50 µm y una anchura entre 1 y 500 µm.

11. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque el electrodo de trabajo (WE) se sitúa a la salida (3) de los canales de separación (1) a una distancia entre 5 y 100 µm.

12. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque el array de microelectrodos (9) está formado por una serie de 2 a 100 microelectrodos.

13. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque el array de microelectrodos es interdigitado (10).

14. Microchip según la reivindicación 13 caracterizado porque el array de microelectrodos interdigitado está formado por dos series de 2 a 100 microelectrodos.

15. Microchip según la reivindicación 1 ó 13 caracterizado porque el array de microelectrodos interdigitados tienen un espesor entre 100 nm y 20 µm y una anchura entre 1 y 50 µm.

16. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque la situación del array de microelectrodos (9) al final del canal de separación (1) varia entre 50 µm dentro del canal de separación (1) y 100 µm fuera del canal de separación (1).

17. Microchip según la reivindicación 13 caracterizado porque la situación del array de microelectrodos interdigitados (10) al final del canal de separación (1) varía entre 50 µm dentro del canal de separación (1) y 100 µm fuera del canal de separación (1).

18. Microchip según la reivindicación 11 ó 16 ó 17 caracterizado porque la separación entre los electrodos de trabajo (WE), el electrodo de referencia (RE) y el electrodo auxiliar (AE) es una relación de distancias, anchura electrodo:espaciado entre electrodos, comprendida entre 1:0.25 y 1:20.

19. Microchip según la reivindicación 1 6 13 caracterizado porque la separación entre los microelectrodos (9 ó 10) es una relación de distancias, anchura microelectrodo:espaciado entre microelectrodos, comprendida entre 1:1 y 1:20.

20. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque tiene un sólo canal de separación (1) con un depósito de disolución reguladora (A) y un depósito de detección (B), un sólo canal de inyección (2) con dos depósitos de muestra (C) y que integra un sistema de detección electroquímico con un único electrodo de trabajo (WE), un electrodo de referencia (RE) y un electrodo auxiliar (AE) en serie contenidos en el depósito de detección (B); un electrodo de voltaje de separación (5) contenido en el depósito de disolución reguladora (A); y unos electrodos de voltaje de inyección (6) contenidos en los depósitos de muestra (C).

21. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque tiene dos canales de separación (1) con dos depósitos de disolución reguladora (A) y dos depósitos de detección (B), un sólo canal de inyección (2) con dos depósitos de muestra (C) y que integra un sistema de detección electroquímico con dos electrodos de trabajo (WE) en paralelo, un electrodo de referencia (RE) y un electrodo auxiliar (AE) en serie contenido en los depósitos de detección (B); un electrodo de voltaje de separación (5) contenido en el depósito de disolución reguladora (A); y unos electrodos de voltaje de inyección (6) contenidos en los depósitos de muestra (C).

22. Microchip según la reivindicación 21 caracterizado porque los canales de separación (1) son paralelos y se encuentran a una distancia comprendida entre 0.25 y 5 mm.

23. Microchip según la reivindicación 1 caracterizado porque tiene n (n = 3) canales de separación (1) con n depósitos de disolución reguladora (A) y un único depósito de detección (B) común; n canales de inyección (2) con n depósitos de muestra (C) y que integra un sistema de detección amperométrico basado en n electrodos de trabajo (WE), un electrodo de referencia (RE) y un electrodo auxiliar (AE) situados en el depósito de la detección (B); un electrodo de voltaje de separación (5) común a los n canales de separación contenido en los depósito de disolución reguladora (A); y n electrodos de voltaje de inyección (6) contenidos en los n depósitos de muestra (C).

24. Uso del microchip de la reivindicación 1 para la separación y detección de neurotransmisores, compuestos fenólicos, minas, nitrocompuestos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, iones y complejos metálicos.