Un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende:

un canal microfluídico y

un reticulado que comprende una red de intersticios dentro del canal microfluídico, en el que

el dispositivo emplea un campo que propele las partículas que se separan en el canal microfluídico; y caracterizado porque

un flujo del campo procedente de los intersticios se divide desigualmente en un componente principal del flujo y un componente secundario del flujo en intersticios subsiguientes en la red, de tal modo que la dirección media del componente secundario del flujo no es paralela a la dirección media del campo, y, cuando

se introducen partículas en el reticulado, las partículas que tienen un tamaño menor que un tamaño crítico predeterminado son transportadas, por lo general, en la dirección media del campo, y

las partículas que tienen un tamaño al menos igual que el tamaño crítico son transportadas, por lo general, en la dirección media del componente principal del flujo, separándose con ello las partículas según su tamaño

Procedimiento de separación continua de partículas usando reticulados de obstáculos alineados asimétricamente respecto a campos.

Campo de la invención

La presente invención versa acerca de procedimientos y dispositivos para separar partículas según su tamaño. Más específicamente, la presente invención versa acerca de un procedimiento y un dispositivo microfluídicos para la separación de partículas según su tamaño.

Antecedentes

La separación por tamaño o masa es una técnica analítica y preparativa fundamental en biología, medicina, química y en la industria. Los procedimientos convencionales incluyen la electroforesis en gel, el fraccionamiento campo-flujo, la sedimentación y la cromatografía por exclusión de tamaño [J. C. Giddings, Unified Separation Science (Wiley, Nueva York, 1991)]. La electroforesis en gel utiliza un campo eléctrico para hacer que las moléculas cargadas se separen en un medio en forma de gel, que hace de matriz de colado. Las moléculas se cargan inicialmente en un extremo de la matriz de gel, y se separan en zonas componentes según migran por el gel. El fraccionamiento campo-flujo se lleva a cabo en un canal fino a modo de cinta en el que el perfil del flujo es parabólico. Se cargan las partículas como una zona de muestra, y luego fluyen por el canal. La separación se produce cuando partículas de propiedades diferentes fluyen en diferentes posiciones de flujo, debido a la influencia de un campo, lo que da como resultado velocidades de migración diferentes. El campo se aplica perpendicular al flujo. La sedimentación utiliza la aceleración gravitatoria o centrífuga para obligar a las partículas a atravesar un fluido. Las partículas migran por el fluido a diferentes velocidades, dependiendo de su tamaño y densidad, y, por ello, se separan. La cromatografía por exclusión de tamaño (CET) utiliza un tubo lleno de perlas porosas, mediante las cuales se lavan moléculas de muestra. Las moléculas menores que los poros pueden entrar en las perlas, lo que alarga su trayectoria de migración, mientras que las mayores que los poros únicamente pueden fluir entre las perlas. De esta forma, las moléculas menores son retenidas, como media, durante más tiempo y así se separan de las moléculas mayores. Sin embargo, las zonas se amplían al pasar por la columna, porque hay muchas trayectorias de migración posibles para cada molécula, y cada trayectoria tiene una longitud diferente, y, en consecuencia, un tiempo de retención diferente. Esta ampliación de la zona de trayectorias múltiples (difusión de Eddy) es un factor fundamental que limita la resolución. J. C. Giddings, Unified Separation Science (John Wiley & Sons, Nueva York, 1991). Otros procedimientos de separación según el tamaño, incluyendo la electroforesis en gel y el fraccionamiento campo-flujo, también conllevan procesos estocásticos, lo que puede limitar su resolución. J. C. Giddings, Nature 184, 357 (1959); J. C. Giddings, Science 260, 1456 (1993). El documento US 5 837 115 da a conocer un aparato y un procedimiento de clasificación para fraccionar y simultáneamente ver microestructuras individuales, como células libres, virus, macromoléculas o partículas diminutas en un medio fluido, en el que el aparato de clasificación está compuesto de un sustrato que tiene un receptáculo situado en su interior, teniendo el receptáculo paredes laterales y un suelo, y en el que se coloca un reticulado de obstáculos dentro del receptáculo, elevándose los obstáculos del suelo del receptáculo.

No puede insistirse lo suficiente en la necesidad de una separación fiable y rápida de grandes biomoléculas, como el ADN y las proteínas. Recientemente, se han demostrado estructuras fabricadas a micro/nanoescala que aprovechan diversas ideas para la separación del ADN. El uso de estructuras fabricadas a micro/nanoescala como matrices de colado para la separación de partículas se dio a conocer en la patente estadounidense nº 5.427.663. Según ese documento, las moléculas de ADN se separan según son impulsadas por campos eléctricos a través de un reticulado de postes. La patente estadounidense nº 5.427.663 da a conocer un aparato y un procedimiento de clasificación para fraccionar y simultáneamente ver microestructuras y macromoléculas individuales, incluyendo ácidos nucleicos y proteínas. Según la patente estadounidense nº 5.427.663, se proporciona un sustrato que tiene un receptáculo poco profundo situado en un lateral del mismo, y se proporciona un reticulado de obstáculos que sobresalen del suelo de los receptáculos para que interactúen con las microestructuras y retarden la migración de las mismas. Para crear la migración de las microestructuras, se fabrican electrodos en dos lados del receptáculo para generar campos eléctricos en el fluido. Esto es análogo a la electroforesis convencional en gel. Sin embargo, el gel es sustituido por estructuras micromecanizadas como matrices de colado.

Se han dado a conocer varias matrices de colado microfabricadas. En un diseño, reticulados de obstáculos clasifican moléculas de ADN según sus coeficientes de difusión usando un campo eléctrico aplicado [Chou, C. F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 13762 (1999)]. El campo eléctrico propele las moléculas directamente por los intersticios entre los obstáculos, en el que cada intersticio está directamente debajo de otro intersticio. Los obstáculos están modelados de forma que la difusión esté polarizada en una dirección según fluye el ADN por el reticulado. Tras fluir a través de muchas filas de obstáculos, se detectan ADN con diferentes coeficientes de difusión en diferentes posiciones. Sin embargo, dado que el coeficiente de difusión para las moléculas grandes es reducido, los reticulados asimétricos de obstáculos son lentos, típicamente con tiempos de utilización de más de 2 horas. En un segundo diseño, trampas entrópicas que consisten en una serie de muchos estrechamientos angostos (< 100 nm) separadas por regiones más anchas y más profundas (algunos micrómetros) reducen el tiempo de separación a aproximadamente 30 minutos [Han, J. & Craighead, H. G., Science 288, 1026 (2000)]. Dado que los estrechamientos se fabrican para que sean más angostos que el radio de giro para que se separen las moléculas de ADN, actúan como barreras entrópicas. La probabilidad de que una molécula supere la barrera entrópica depende del peso molecular, y, por ello, las moléculas de ADN migran en el reticulado de trampas entrópicas con movilidades diferentes. Las moléculas mayores, como más grados de libertad configuracional, migran con mayor rapidez en estos dispositivos. En un tercer diseño, un reticulado hexagonal de postes actúa como matriz de colado en una electroforesis de campo por impulsos para la separación de moléculas de ADN en el intervalo de 100 kb [Huang, L. R., Tegenfeldt, J. O., Kraeft, J. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Cox, E. C., Nat Biotechnol. 20,1048 (2002)]. Sin embargo, generalmente estos dispositivos requieren características con tamaños comparables o menores que los de las moléculas que se fraccionan. Han, J. & Craighead, H. G. Separation of long DNA molecules in a microfabricated entropic trap array. Science 288, 1026-1029 (2000); Turner, S. W., Cabodi, M., Craighead, H. G. Confinement-induced entropic recoil of single DNA molecules in a nanofluidic structure. Phys Rev Lett. 2002 Mar 25; 88(12):128103; Huang, L. R., Tegenfeldt, J. O., Kraeft, J. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Cox, E. C. A DNA prism for high-speed continuous fractionation of large DNA molecules. Nat Biotechnol. 2002 Oct; 20(10): 1048-51; y Huang, L. R., Silberzan, P., Tegenfeldt, J. O., Cox, E. C., Sturm, J. C., Austin, R. H. y Craighead, H. Role of molecular size in ratchet fractionation. Phys. Rev. Lett. 89, 178301 (2002). La necesidad de rasgos de tamaño pequeño tienen los siguientes efectos perjudiciales: (i) los dispositivos no pueden fraccionar moléculas pequeñas, como las proteínas; (ii) los dispositivos pueden tener un rendimiento muy bajo y, por ello, no son instrumentos útiles para la preparación de muestras; (iii) los dispositivos únicamente pueden analizar un volumen muy pequeño de muestras, y, por lo tanto, requieren habitualmente muestras concentradas o equipos caros para una detección de muestras; y (iv) la fabricación de los dispositivos requiere técnicas punteras de fabricación y, por ello, de costo elevado.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para separar partículas conforme a la reivindicación 1.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño...

1. Un dispositivo microfluídico para separar partículas según su tamaño que comprende:

2. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que el reticulado es un reticulado ordenado de obstáculos.

3. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 2, en el que el reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo.

4. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que el reticulado ordenado de obstáculos comprende obstáculos dispuestos en filas, en el que cada fila subsiguiente de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a la fila anterior.

5. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que el reticulado ordenado de obstáculos está inclinado un ángulo ?, desviado con respecto a la dirección del campo.

6. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el campo es un flujo fluido, eléctrico, electroforético, electroosmótico, centrífugo, gravitatorio, hidrodinámico, un gradiente de presión o una acción capilar.

7. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 6, en el que el campo es un flujo fluido.

8. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 6, en el que el campo es un campo eléctrico.

9. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las partículas son bacterias, células, orgánulos, virus, ácidos nucleicos, proteínas, complejos proteínicos, polímeros, polvos, látex, emulsiones o coloides.

10. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las partículas son moléculas de ADN.

11. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además una primera salida, configurada para aceptar partículas mayores que el tamaño crítico predeterminado, y una segunda salida, configurada para aceptar partículas menores que el tamaño crítico predeterminado.

12. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el dispositivo comprende reticulados múltiples en serie dentro del canal microfluídico, en el que cada reticulado tiene un tamaño crítico dife- rente.

13. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 12, en el que un último reticulado de la serie comprende al menos una salida configurada para aceptar partículas transportadas en la dirección media del componente principal del flujo de al menos un reticulado en la serie.

14. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un límite, de tal modo que cuando las partículas que tienen un tamaño mayor que el tamaño crítico predeterminado se introducen en el reticulado, las partículas que tienen un tamaño mayor que el tamaño crítico predeterminado son transportadas por lo general hasta el límite, concentrándose por ello las partículas en el límite.

15. Un procedimiento para separar partículas según su tamaño, que comprende:

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la red de intersticios está construida de un reticulado de obstáculos.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el reticulado de obstáculos es un reticulado ordenado de obstáculos.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el reticulado ordenado de obstáculos es asimétrico con respecto a la dirección media del campo.

19. El procedimiento de las reivindicaciones 17 y 18, en el que el reticulado ordenado de obstáculos comprende obstáculos dispuestos en filas, en el que cada fila subsiguiente de obstáculos está desplazada lateralmente con respecto a la fila anterior.

20. El procedimiento de las reivindicaciones 17 y 18, en el que el reticulado ordenado de obstáculos está inclinado un ángulo ?, desviado con respecto a la dirección del campo.

21. El procedimiento de una reivindicación cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que el campo es un flujo fluido, eléctrico, electroforético, electroosmótico, centrífugo, gravitatorio, hidrodinámico, un gradiente de presión o una acción capilar.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el campo es un flujo fluido.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el campo es un campo eléctrico.

24. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que las partículas son bacterias, células, orgánulos, virus, ácidos nucleicos, proteínas, complejos proteínicos, polímeros, polvos, látex, emulsiones o coloides.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las partículas son moléculas de ADN.

26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, que comprende además introducir las partículas que tienen al menos el tamaño crítico predeterminado en una primera salida, y las partículas menores que el tamaño crítico predeterminado en una segunda salida.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, que comprende además transportar las partículas que tienen un tamaño al menos igual de grande que el tamaño crítico predeterminado hasta un límite del canal microfluídico, concentrando con ello las partículas en el límite.