SECUENCIA DE ADN Y PREPARACIÓN RECOMBINANTE DE ALÉRGENOS MAYORES DEL GRUPO 4 DE CEREALES.

Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales,

seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 1 y 3

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales (Triticeae). La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y variantes se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos), que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas, entre otros, alérgenos del polen de cereales (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001). Entre los alérgenos del polen de cereales tienen una especial importancia los alérgenos del centeno.

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas estos alérgenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.

Los alérgenos del polen de diferentes especies de la familia de las gramíneas (Poaceae) se clasifican en grupos que son homólogos entre sí.

En particular las moléculas del grupo 4 de alérgenos mayores presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6):361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383:1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1):43-51).

Hasta ahora no se conoce una secuencia de ADN completa de ningún alérgeno mayor del grupo 4.

De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación enzimática y se han secuenciado los péptidos:

DIYNYMEPYVSK (SEQ ID NO 13),

VDPTDYFGNEQ (SEQ ID NO 14),

ARTAWVDSGAQLGELSY (SEQ ID NO 15),

y GVLFNIQYVNYWFAP (SEQ ID NO 16, Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

También se han obtenido por proteolisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon):

KTVKPLYIITP (SEQ ID NO 17),

KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (SEQ ID NO 18),

TVKPLYIITPITAAMI (SEQ ID NO 19),

LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (SEQ ID NO 20), KWQTVAPALPDPNM (SEQ ID NO 21), VTWIESVPYIPMGDK (SEQ ID NO 22), GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (SEQ ID NO 23), TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (SEQ ID NO 24), YRDLDLGVNQVVG (SEQ ID NO 25), SATPPTHRSGVLFNI (SEQ ID NO 26), y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (SEQ ID NO 27, Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys. Research

Communication 280: 738-743). Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con las secuencias

siguientes: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 28) y GLIEFPAGV (SEQ ID NO 29, Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348). Como primera secuencia de un alérgeno del grupo 4 se ha resuelto por parte del inventor de la presente solicitud de

patente la secuencia aún no publicada de Phl p 4 de Phleum pratense (SEQ ID NO 11) y se describe en la solicitud internacional WO 04/000881.

Hasta ahora no se sabe nada sobre las secuencias de los alérgenos mayores de grupo 4 de los cereales (Triceae). Por consiguiente, el objeto en el que se basa la presente invención consiste en la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de los cereales, en particular del alérgeno Sec c 4 de centeno (Secale cerale) (SEQ ID NO 1, 3), Hor v 4 de cebada (Hordeum vulgare) (SEQ ID NO 5) y Tri a 4 de trigo (Triticum aestivum) (SEQ ID NO 7, 9), así como de las correspondientes moléculas de ADN recombinante sobre cuya base se pueden expresar los alérgenos como proteína y se puede hacer accesible un aprovechamiento significativo como tal o en forma modificada. La secuencia de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) ha sido el punto de partida para la presente invención.

Índice de secuencias según la invención A las secuencias de ADN y proteínas de los alérgenos maduros según SEQ ID NO 1-10 las precede una secuencia señal. Con los codones de parada TGA o TAG en la secuencia de ADN termina el segmento codificante.

- Secuencia de ADN de Sec c 4. (a) Isoforma Sec c 4.01 (SEQ ID NO 1), (b) Isoforma Sec c 4.02 (SEQ ID NO 3).

- Secuencias de proteína (SEQ ID NO 2, 4) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 1 y 3.

- Secuencia de ADN de Hor v 4 (SEQ ID NO 5).

- Secuencia de proteína (SEQ ID NO 6) derivada de la secuencia de ADN según SEQ ID NO 5.

- Secuencia de ADN de Tri a 4. (a) Isoforma Tri a 4.01 (SEQ ID NO 7), (b) Isoforma Tri a 4.02 (SEQ ID NO 9).

- Secuencias de proteína (SEQ ID NO 8, 10) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 7 y 9.

- Secuencia de ADN de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) según SEQ ID NO 5 del documento WO 04/000881.

- Secuencia de proteína de Phl p 4 (SEQ ID NO 12) según SEQ ID NO 6 del documento WO 04/000881. Descripción de la invención Con la presente invención se proporcionan ahora por primera vez las secuencias de ADN del alérgeno mayor del polen

de cereales Sec c 4, según SEQ ID NO 1 y 3.

Por consiguiente, son objeto de la presente invención las moléculas de ADN seleccionadas a partir de las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NO 1 y 3.

La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico.

Por consiguiente, también son objeto de la invención las correspondientes secuencias parciales, una combinación de secuencias parciales o mutaciones de intercambio, eliminación o adición, los cuales codifican para un fragmento inmunomodulador y reactivo frente a células T de un alérgeno del grupo 4 de Poaceae.

Con el conocimiento de la secuencia de ADN de los alérgenos que existen en la naturaleza ahora sólo es posible preparar estos alérgenos como proteínas recombinantes, que se pueden emplear en el diagnóstico y la terapia de enfermedades alérgicas (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Sería posible una optimización más amplia de la terapia con alérgenos pre-parados de forma recombinante. Cócteles definidos,... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales, seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 1 y 3.

2. Vector de expresión de ADN recombinante o un sistema de clonación que contiene una molécula de ADN según la reivindicación 1, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión.

3. Organismo huésped, transformado con una molécula de ADN según la reivindicación 1 o un vector de expresión según la reivindicación 2.

4. Procedimiento para la preparación de un polipéptido, codificado mediante una secuencia de ADN según la reivindicación 1, mediante cultivo de un organismo huésped según la reivindicación 3 y obtención del correspondiente polipéptido a partir del cultivo.

5. Polipéptido que comprende una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 2 y 4, el cual codifica para una secuencia de ADN según la reivindicación 1.

6. Polipéptido que comprende el alérgeno maduro de las secuencias de aminoácidos según la reivindicación 5, seleccionado del siguiente grupo de secuencias de aminoácidos

- una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 2 o 4.

7. Polipéptido según la reivindicación 5 o 6 como medicamento.

8. Preparación farmacéutica que contiene al menos un polipéptido según la reivindicación 7 para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae.

9. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 7 para la preparación de un medicamento para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.

10. Molécula de ADN según la reivindicación 1 como medicamento.

11. Vector de expresión recombinante según la reivindicación 7 como medicamento.

12. Preparación farmacéutica que contiene al menos una molécula de ADN según la reivindicación 10 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 11 para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.

13. Uso de al menos una molécula de ADN según la reivindicación 10 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.