PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIÓN DE INTERFERÓN BETA.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de un interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante usando cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa. Antecedentes de la técnica Los interferones en un sentido amplio son mensajeros extracelulares que median en la reactivad de los huéspedes y la evolución de las familias de proteínas conservadas que son liberadas en un tamaño relativamente pequeño a partir de células. Los interferones son liberados a partir de células que producen interferón en respuesta a la estimu- lación por virus, ARNs de doble hebra, diversos microorganismos, o citocinas tal como TNF o IL-1, y, a continuación, se unen a las superficies de células próximas con receptores de interferones. Posteriormente, los interferones inducen la síntesis de diversas proteínas de manera tal que se mantiene la reactividad y homeostasis de los huéspedes mediante el consiguiente señalamiento en las células. En consecuencia, los interferones actúan como proteínas señal antivíricas, antiproliferativas, e inmunes en los cuerpos y tienen efectos de antiproliferación directos sobre células de cáncer, y por ello, han merecido mucha atención como agentes terapéuticos [Postka S., Langer, J.A. y Zoon, K.C., Interferons and their actions, Annu. Rev. Biochem., vol. 56, págs. 727-777, (1987)]. Los interferones pertenecen a la clase de substancias fisiológicamente activas, helicolidales. De acuerdo con las características y funcionalidades fisicoquímicas, existen dos clases de interferones: tipo 1 y 2. El interferón- alfa, - beta, -tau, y -épsilon son partes del interferón tipo 1 [Weissman, C y Weber, H, The Interferon genes, Prog. Nucleic Acid. Res. Biol., vol. 33, págs. 251-300, (1986)] y el interferón gamma es una parte del interferón tipo 2. Entre ellos, los interferones betas que pertenecen al interferón tipo 1 son proteínas que muestran especificidad de especies. Los interferones betas son denominados igualmente como interferones fibroblastos considerando sus orígenes y como interferones estables a pH2, considerando las características biológicas. Los interferones betas se unen a los mis- mos receptores de superficies de células, conjuntamente con interferones alfas que pertenecen al interferón tipo 1 y, a continuación, inducen la transcripción de factores antivíricos en respuesta a un consiguiente sistema de células señal. Los interferones betas son glucoproteínas (aproximadamente 20% de resto azúcar) con una masa molecular de aproximadamente 20 kDa y proteínas de cadena sencilla que consisten en 166 aminoácidos. Se conoce un sitio de N-glucosilación que juega un papel en el incremento de la estabilidad o solubilidad del material en cuanto como funciones fisicoquímicas, más que como participante en la actividad biológica o la antigenicidad [Karpusas, M., Whytty, A., Runkel, L., y Hochman, P. The structure of human interferon-ß: implications for activity CMLS, vol. 54, págs. 1203-1216, (1998)]. El avance en la tecnología de recombinación genética ha permitido la determinación de la secuencia de aminoácidos del interferón beta humano y la clonación y expresión del interferón beta humano en E. coli [Taniguchi, Gene, vol. 10, págs. 11-15, (1980)]. Además, se ha informado de la expresión de interferón beta en células de ovario de hámster chino (CHO) [Patente de EE.UU. 4.966.843, Patente de EE.UU. 5.376.567, y Patente de EE.UU. 5.795.779]. Actualmente, se fabrican interferones betas mediante tecnología de recombinación de genes y se encuentran comercialmente disponibles bajo el nombre comercial de Betaseron ® , Avone ® y Rebit ® . Es sabido que los interferones betas recombinantes son eficaces en el retraso de la progresión de la esclerosis múltiple en pacientes con los signos de la enfermedad y en el alivio de los dolores de la enfermedad. Además, los interferones betas recombinantes son ampliamente usados como agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple, y al mismo tiempo son eficaces en la regulación no específica de la respuesta inmune humana, la respuesta inmune a infección vírica y la antiproliferación de células de cáncer. Las tecnologías de purificación actualmente disponibles de interferones betas recombinantes expresados en células CHO implican 3-5 procedimientos de purificación que incluyen la purificación primaria mediante cromatografía de afinidad (Patente de EE.UU. 4.278.661, Patente de EE.UU. 4.289.689, Patente de EE.UU. 4.541.952, Patente de EE.UU. 4.808.523, etc.), cromatografía de quelato metálico (Patente de EE.UU. 4.257.938, Patente de EE.UU. 4.359.389, Patente de EE.UU. 4.541.952, Patente de EE.UU. 5.244.655, etc.), cromatografía CPG (vidrio de poro controlado) (Patente de EE.UU. 4.359.389, Patente de EE.UU. 5.066.786, Patente de EE.UU. 5.244.655, etc.), o cromatografía Concanavalin A (Patente de EE.UU. 4.289.689, Patente de EE.UU. 4.658.017, etc.), seguido de cromatografía de intercambio de cationes y cromatografía de fase inversa. En las tecnologías de purificación comunes anteriormente descritas, la cromatografía de quelato metálico puede causar contaminación ambiental debido al uso de metal pesado. La cromatografía CPG o Concanavalin A tiene pobre especificidad de purificación. Es decir, la cromatografía Concanavalin A basada en la unión selectiva con muchas proteínas de cadena azúcar contenidas en un cultivo de células CHO muestra baja especificidad. Una co- 2   lumna CPG permite la separación por tamaño molecular después de unión con una proteína. Sin embargo, la eficacia y pureza de separación de los interferones betas son menores que los de la cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de columna Blue Sepharose). Además, las tecnologías de purificación comunes mediante cromatografía de afinidad implican el lavado y elución con etileno glicol usando un anticuerpo monoclonal y/o una resina coloreada. Sin embargo, la cromatografía de afinidad que usa un anticuerpo monoclonal de manera separada, requiere la eliminación de la forma no glucosilada del interferón beta, lo cual hace difícil la producción en masa. En particular, el etileno glicol usado en el lavado y la elución es muy tóxico en el cuerpo, lo cual restringe la aplicación de purificación real. Mientras tanto, la Patente de EE.UU. No. 4.483.849 divulga un procedimiento para la purificación y estabilización de interferón beta que usa propileno glicol, en lugar de etileno glicol tóxico, mediante cromatografía de afinidad. El procedimiento divulgado en este documento de patente incluye la aplicación de un cultivo que contiene interferón a una columna de afinidad coloreada tal como Affi-Gel Blue equilibrada, el lavado de la columna con una solución tampón de NaCl/PO4 1,0 M y una solución tampón de NaCl/PO4 1,0 M que contiene 40% de propileno glicol, y la elución del interferón con 50% de propileno glicol. Incluso considerando que el procedimiento de este documento de patente implica el lavado y la elución de la columna, coexiste un pico del producto final deseado y un pico de impureza, disminuyéndose, de esta forma, la pureza. Divulgación de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para la purificación de interferón beta, el cual incluye la recuperación de un producto de purificación primaria de alta pureza de interferón beta mediante cromatografía de afinidad potenciada usando propileno glicol no tóxico, seguido de cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (RP- HPLC). En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento para la purificación de interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante, que comprende la realización de cromatografía de afinidad y RP-HPLC, el cual incluye el lavado y elución con una solución tampón específica. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la purificación de interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante mediante cromatografía de afinidad y RP-HPLC, en el que la cromatografía de afinidad incluye: adsorción del cultivo que contiene interferón beta en una columna de cromatografía de afinidad equilibrada, seguido de lavado con una solución tampón de equilibrado; lavado de la columna con una solución tampón de lavado A de pH 6,5-7,5 que contiene 30-60% en peso de propileno glicol y una solución tampón de lavado B de pH 6,5-7,5 que contiene 10-30% en peso de propileno glicol y NaCl 1-2 M; y elución de una fracción que contiene interferón beta humano con una solución tampón de pH 6,5-7,5 que contiene 40-60% en peso de propileno glicol y NaCl 1-2 M. En el procedimiento de purificación de la presente invención, los... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la purificación de interferón beta humano a partir de un cultivo que contiene interferón beta humano recombinante, que comprende la realización de cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (RP-HPLC), en el que la cromatografía de afinidad comprende: adsorción del cultivo que contiene interferón beta en una columna de cromatografía de afinidad equilibrada, seguido de lavado con una solución tampón de equilibrado; seguido de lavado de la columna con una primera solución tampón de lavado A de pH 6,5-7,5 que contiene 30-60% de propileno glicol; seguido de lavado de la columna con una segunda solución tampón de lavado C de pH 6,5-7,5 que contiene NaCl 1-2 M; seguido de lavado de la columna con una tercera solución tampón de lavado B de pH 6,5-7,5 que contiene 10-30% de propileno glicol y NaCl 1-2 M y, a continuación, elución de una fracción que contiene interferón beta humano con una solución tampón de pH 6,5-7,5 que contiene 40-60% de propileno glicol y NaCl 1-2 M. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada solución tampón usada en el lavado y la elución es una solución tampón de fosfato sódico o una solución tampón de fosfato potásico. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que una solución obtenida mediante la cromatografía de afinidad se somete a diafiltración con una membrana de ultrafiltración con un corte de peso molecular de 10.000 daltons antes de la RP-HPLC. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que en la RP-HPLC, una muestra obtenida mediante la diafiltración se carga sobre una columna y, a continuación, se eluye una fracción que contiene interferón beta humano a pH 2-5 mediante un gradiente de concentración de etanol que contiene HCl. 7   8   9     11   12