PROTEÍNAS ACTIVAS BIOLÓGICAS QUE TIENEN ESTABILIDAD AUMENTADA IN VIVO Y/O IN VITRO.

Proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios,

en la que (a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y (b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar y en la que dicho segundo dominio consiste en residuos de alanina, serina y prolina mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/005020.

Solicitante: TECHNISCHE UNIVERSITAT MUNCHEN.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: ARCISSTRASSE 21 80290 MÜNCHEN ALEMANIA.

Inventor/es: SKERRA, ARNE, THEOBALD,Ina, SCHLAPSCHY,Martin.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 20 de Junio de 2008.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/47 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
  • C07K14/52 C07K 14/00 […] › Citoquinas; Linfoquinas; Interferones.

Clasificación PCT:

  • A61K38/17 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
  • C07K14/435 C07K 14/00 […] › de animales; de humanos.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/62 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2362386_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas biológicamente activas que comprenden al menos dos dominios en las que un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica y un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar y en las que dicho segundo dominio consiste en residuos de alanina, serina y prolina, mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa. Además, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas biológicamente activas de la invención y vectores y células que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los compuestos de la invención así como para usos específicos de las proteínas biológicamente activas, moléculas de ácido nucleico, vectores y células de la invención.

Las proteínas plasmáticas comunes tales como albúmina sérica humana (HSA) e inmunoglobulinas (Ig), incluyendo anticuerpos humanizados, muestran largas vidas medias, normalmente de 2 a 3 semanas, lo que puede atribuirse a su interacción específica con el receptor Fc neonatal (FcRn), lo que conduce a reciclaje endosómico (Ghetie (2002) Immunol Res 25:97-113). En cambio, la mayoría de las demás proteínas de interés farmacéutico, en particular fragmentos de anticuerpos recombinantes, hormonas, interferones, etc. experimentan un rápido aclaramiento (en sangre). Esto es particularmente cierto para proteínas cuyo tamaño es inferior al valor umbral para la filtración renal de aproximadamente 70 kDa (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277). En estos casos, la vida media plasmática de una proteína farmacéutica sin modificar puede ser considerablemente menor que una hora, haciéndola así esencialmente inútil para la mayoría de aplicaciones terapéuticas. Con el fin de lograr una acción farmacológica sostenida y también un cumplimiento mejorado del paciente, extendiéndose los intervalos de dosificación requeridos hasta varios días o incluso semanas, se establecieron previamente varias estrategias para los fines de desarrollo de fármacos biofarmacéuticos.

En primer lugar, se ha empleado el mecanismo de reciclaje de las proteínas plasmáticas naturales produciendo proteínas de fusión con la parte Fc de Ig, por ejemplo, Enbrel®, un híbrido entre el dominio extracelular del receptor de TNF e IgG1 humana (Goldenberg (1999) Clin Ther 21:75-87) o con albúmina sérica, por ejemplo, Albuferon®, una fusión correspondiente de IFN con HSA (Osborn (2002) J Pharmacol Exp Ther 303:540-548). También se ha utilizado albúmina con su alta concentración plasmática de 600 M de manera indirecta, sirviendo como vehículo portador para productos biofarmacéuticos que están dotados de una función de unión a albúmina, por ejemplo, mediante fusión con un dominio de unión a albúmina (ABD, albumin-binding domain) bacteriano de proteína G estreptocócica (Makrides (1996) J Pharmacol Exp Ther 277:534-542) o con un péptido seleccionado contra HSA de una biblioteca de presentación en fago (Dennis (2002) J Biol Chem 277:35035-35043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297).

En segundo lugar, un metodología fundamentalmente diferente para prolongar la vida media plasmática de productos biofarmacéuticos es la conjugación con polímeros químicos altamente solvatados y fisiológicamente inertes, ampliando de ese modo de manera eficaz el radio hidrodinámico de la proteína terapéutica más allá del tamaño de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (Caliceti (2003) loc. cit.). El acoplamiento covalente en condiciones suaves desde el punto de vista bioquímico con derivados activados de polietilenglicol (PEG), o bien aleatoriamente mediante cadenas laterales de Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977) o bien por medio de residuos de Cys introducidos específicamente (Rosendahl (2005) BioProcess International 3:52-60) ha sido moderadamente satisfactorio y está aplicándose actualmente en varios fármacos aprobados. Se han logrado ventajas correspondientes especialmente junto con pequeñas proteínas que tienen una actividad farmacológica específica, por ejemplo, Pegasys®, un IFN--2a químicamente pegilado recombinante (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870).

Sin embargo, el acoplamiento químico de una proteína biológicamente activa con polímeros sintéticos puede tener desventajas con respecto a la producción y el desarrollo biofarmacéuticos. Los derivados de PEG adecuados son caros, especialmente ya que es necesaria una alta pureza, y su conjugación con una proteína recombinante requiere etapas adicionales de procesamiento y purificación in vitro, que disminuyen el rendimiento y elevan los costes de fabricación. De hecho, PEG está contaminado a menudo con aldehídos y peróxidos (Ray (1985) Anal Biochem 146:307-312) y es propenso intrínsecamente a la degradación química con el almacenamiento en presencia de oxígeno. Además, la función farmacéutica de una proteína terapéutica puede dificultarse si se modifican cadenas laterales de aminoácidos en las proximidades de su sitio activo bioquímico por el proceso de pegilación. Además, el acoplamiento químico con polímeros sintéticos da como resultado habitualmente una mezcla heterogénea de moléculas que pueden mostrar una varianza sustancial de la actividad in vivo.

En tercer lugar, se ha propuesto el uso de análogos de glicosilación de proteínas biológicamente activas en las que se introducen nuevas secuencias consenso de glicosilación de unión a N para prolongar la vida media sérica; véanse el documento WO 02/02597; Perlman (2003) J Clin Endocrinol Metab 88:2327-2335; o Elliott (2003) Nat Biotechnol 21:414-420. Sin embargo, las proteínas glicosiladas mediante ingeniería genética descritas presentaban una actividad in vivo alterada, lo que indica que las nuevas cadenas laterales de hidrato de carbono influyen en la actividad biológica de la proteína modificada por ingeniería genética. Además, es probable que las cadenas laterales de hidrato de carbono adicionales aumenten la antigenicidad de moléculas activas biológicas resultantes, lo que plantea problemas de seguridad sustanciales.

Además, se ha notificado que proteínas de fusión que comprenden la secuencia de repetición artificial derivada de Trypanosoma cruzi PSTAD inducen una vida media plasmática prolongada de trans-sialidasa (Alvarez (2004) J Biol Chem 279:3375-3381). Sin embargo, se ha notificado que tales repeticiones derivadas de Trypanosoma cruzi inducen una respuesta inmunitaria humoral (Alvarez (2004) loc. cit.). Por consiguiente, se desean medios alternativos para prolongar la acción de proteínas biológicamente activas.

El problema técnico subyacente a la presente invención es la provisión de proteínas biológicamente activas con una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro. La solución al problema técnico anterior se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, esta invención se refiere a una proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios en la que

(a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y

(b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar y en la que dicho segundo dominio consiste en residuos de alanina, serina y prolina, mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

Según esta invención, dicho segundo dominio que forma/que adopta una conformación de espiral al azar puede mediar una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa. Dicho segundo dominio, por tanto, conduce a una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de una proteína dada (o un fragmento de la misma) que tiene una/o que media una actividad biológica dada, tal como se define a continuación en el presente documento.

Tal como se documenta a continuación en el presente documento y en los ejemplos adjuntos,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios, en la que

(a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y

(b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar y en la que dicho segundo dominio consiste en residuos de alanina, serina y prolina

mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

2. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 1, en la que dicho segundo dominio que forma una conformación de espiral al azar comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en la que dichas repeticiones consisten en residuos de Ala, Ser y Pro y en la que no más de 6 residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.

3. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 1 ó 2, en la que dichos residuos de prolina constituyen más del 4% y menos del 40% de los aminoácidos de dicho segundo dominio que forma una conformación de espiral al azar.

4. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 18);

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 20);

APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 22),

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 63),

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 24),

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 26) y

ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 28)

o versiones permutadas circulares o (un) multímero(s) de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias.

5. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en aproximadamente de 100 a 3000 residuos de aminoácido que forman una conformación de espiral al azar.

6. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho polipéptido con actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en moléculas de unión, fragmentos de anticuerpo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas.

7. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 6, en la que dicha molécula de unión se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, peptidomiméticos derivados de CDR, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), lectinas y lipocalinas.

8. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho polipéptido con actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona de crecimiento humana, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, factor de necrosis tumoral, eritropoyetina, factor de coagulación VIII, gp120/gp160, receptores solubles I y II del factor de necrosis tumoral, reteplasa, exendina-4, anakinra, interleucina-2 y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos.

9. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha estabilidad aumentada in vivo de dicha proteína biológicamente activa es una vida media plasmática prolongada de dicha proteína biológicamente activa que comprende dicho segundo dominio que forma una espiral al azar en comparación con dicha proteína biológicamente activa que carece de dicho segundo dominio que forma una espiral al azar.

10. Composición que comprende la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 9.

11. Composición según la reivindicación 10, que es una composición farmacéutica, que comprende además opcionalmente un portador farmacéutico aceptable.

12. Molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 9.

13. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 12.

14. Célula que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 12 o el vector según la reivindicación 13.

15. Método para la preparación de la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 14 y aislar dicha proteína 10 biológicamente activa del cultivo.

16. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, ácido nucleico según la reivindicación 12, vector según la reivindicación 13 o célula según la reivindicación 14 para el uso como medicamento que tiene una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

15 17. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, ácido nucleico según la reivindicación 12, vector según la reivindicación 13 o célula según la reivindicación 14 para su uso como medicamento en el tratamiento de trastornos relacionados con una deficiencia hormonal, enfermedad autoinmune, cáncer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trombosis, infarto de miocardio, diabetes y lesión por reperfusión u otras enfermedades renales.

20 18. Kit que comprende la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el ácido nucleico según la reivindicación 12, el vector según la reivindicación 13 o la célula según la reivindicación 14.


 

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