PROTEÍNA ESPECÍFICA DE CÉLULAS PANCREÁTICAS BETA DE LOS ISLOTES DE LANGERHANS Y SUS APLICACIONES.

El uso de un producto seleccionado entre: (i) una proteína que comprende o consiste en la proteína ZnT-8 de secuencia SEC ID Nº:

2, (ii) un fragmento de al menos 15 aminoácidos consecutivos de ZnT-8, y (iii) una micro­ placa de proteína realizada con una proteína, como se define en (i) o un fragmento como se define en (ii), para detectar, en el suero de un individuo, la presencia de anticuerpos dirigidos contra las células beta de los islotes de Langerhans

La presente invención se refiere a una proteína llamada ZnT-8, expresada de forma específica en las células pancreáticas beta de los islotes de Langerhans, al polinucleótido que codifica dicha proteína que está implicado en la maduración y la exocitosis de la insulina, así como a sus aplicaciones, en particular la selección y estudio de células beta, así como para la exploración de medicamentos activos para la diabetes y la hiperinsulinemia.

La diabetes es una de las enfermedades más frecuentes que afecta al 5% de la población de países industrializados y está en constante aumento en todos los países del mundo (previsión: 300 millones en 2025, de los cuales 2,4 millones en Francia). Entre las diversas formas de la diabetes, la diabetes de tipo I o dependiente de insulina afecta aproximadamente a 500.000 a 1 millón de individuos en los Estados Unidos y 150.000 en Francia, es decir del 0,2 al 0,4% de la población. Los síntomas característicos comprenden un nivel alto de azúcar en la sangre y en la orina, una diuresis importante, hambre y sed intensos así como pérdida de peso.

La diabetes de tipo II no dependiente de insulina (DNDI), descrita también con el nombre de diabetes “grasa” o diabetes de la madurez, a menudo aparece alrededor de la cincuentena. Se trata mediante régimen, toma de medicamentos por vía oral e insulina, después de algunos años de evolución. Hoy en día, 2 millones de franceses se tratan con medicamentos antidiabéticos y/o insulina.

Aunque la diabetes se puede controlar mediante inyecciones de insulina y aportes controlados de glúcidos, las complicaciones asociadas a esta patología necesitan actualmente nuevos procedimientos para su prevención, tratamiento y diagnóstico.

El páncreas comprende dos estructuras distintas tanto morfológica como fisiológicamente:

- el páncreas exocrino que produce las enzimas que intervienen en la digestión (amilasa, lipasa, etc.) y el bicarbonato sódico;

- el páncreas endocrino que produce las hormonas que intervienen en el control de la glucosa en la sangre (insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático).

Las células del páncreas endocrino están organizadas en microórganos dispersos en el páncreas en forma de islotes (islotes de Langerhans o islotes pancreáticos). Cada islote pancreático está compuesto de 4 tipos celulares: las células alfa, beta, delta y las células PP. Las células alfa están situadas en la periferia del islote y segregan el glucagón. Las células beta se encuentran en el centro del islote y son las únicas células que pueden secretar insulina en respuesta a la glucosa. Las células delta están en la periferia y segregan la somatostatina. La función de las células PP es más controvertida (síntesis del polipéptido pancreático).

La ausencia de modelo celular de estudio de la célula beta, así como la ausencia de un medio fiable y eficaz de selección celular adaptado a este tipo de células, frena el estudio de su funcionamiento y por lo tanto la puesta a punto de nuevos procedimientos de tratamiento de la diabetes de tipo I y II.

Entre los tratamientos de la diabetes, además de la administración regular de insulina, una de las vías del control fisiológico de la glucemia y de la normalización de la glucemia en los diabéticos, es el paso por la restauración de una secreción de insulina in vivo a partir de células. Desde este punto de vista, se han propuesto varias soluciones:

- la obtención de células productoras de insulina en animales para realizar un xenotransplante;

- la diferenciación in vitro de células secretoras de insulina a partir de células madre aisladas, con el objetivo de reimplantarlas [1], con el fin de salvar los problemas de inmunidad y la necesidad de un tratamiento inmunosupresor del paciente. Pero la producción de cantidades importantes de células con bajo coste, productoras de insulina por diferenciación de células madre, necesita nuevas herramientas biomoleculares, particularmente útiles para la fenotipificación y la purificación de las células diferenciadas;

- el transplante de islotes pancreáticos; recientemente muchos trabajos han tenido por objeto la preparación de islotes o de células beta pancreáticas con fines terapéuticos. La primera etapa del transplante es extraer el páncreas del donante en estado de muerte cerebral. El aislamiento de los islotes empieza por una digestión enzimática del páncreas mediante una solución de colagenasa. No todos los transplantes requieren una purificación de los islotes digeridos. No obstante, hoy en día la mayoría de los investigadores están de acuerdo en que la purificación de los islotes es necesaria para un alotransplante [2]. Después los islotes se transplantan, a razón de una masa suficiente (mínimo 3000 IEQ/kg) por inyección intraportal (IEQ, por sus siglas en inglés Islet Equivalent, equivalente de islote).

No obstante, el aislamiento de islotes o de células beta pancreáticas necesita medios de selección y de identificación de células beta, específicos y fiables. Trabajos previos han intentado poner a punto procedimientos de marcaje de células beta. Se pueden citar:

- el marcaje por GFP (proteína verde fluorescente) que permite un marcaje fluorescente de la célula. El principal inconveniente de esta técnica es la necesidad de introducir un gen exógeno o transgen en la célula, que necesita además el uso de un vector vírico (adenovirus) [1];

- la técnica basada en la autofluorescencia importante de las células beta [2]. Pero esta técnica carece de especificidad con respecto al tipo celular;

- la incubación de las células con un fluorocromo específico del cinc: el Newport Green [3] o la ditizona [4]. Esta técnica se basa en el contenido importante de cinc de la célula beta. El cinc es un constituyente importante de los gránulos de secreción de insulina, y además, tiene una función en el control de esta secreción [5]. Pero estas

técnicas tienen numerosos inconvenientes: el uso de un producto químico tiene riesgo de toxicidad respecto a la célula beta y carece de especificidad con respecto al tipo celular. Además, la ditizona plantea un problema de fotodegradación rápida [6]:

- la manifestación por reconocimiento indirecto por un clon de células T (documento WO 91/17186) de un antígeno expresado por las células beta. Los trabajos iniciales sobre este antígeno no aportaron resultados en cuanto a caracterización de la secuencia peptídica, ni en cuanto a selectividad de la célula beta con respecto a los otros tipos celulares del islote, ni tampoco del páncreas y el organismo. Trabajos más recientes de los mismos autores muestran una distribución mucho más grande de este antígeno, que de hecho no es específico de la célula beta [7];

- la detección del transportador de glucosa GLUT-2 [15]; aunque este transportador no es específico de las células beta. Por lo tanto, existe una necesidad de un marcador específico y fiable de la célula beta de los islotes

pancreáticos de Langerhans.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar dicho marcador.

El islote de Langerhans acumula grandes cantidades de cinc y por lo tanto necesita un transportador muy eficaz y muy especializado para acumular este cinc en las vesículas de secreción [8]. La insulina, producida y almacenada en la célula beta pancreática, se libera en el medio extracelular por exocitosis en respuesta a estímulos externos, como un aumento de la concentración de glucosa. Este aumento de glucosa provoca una modificación de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio y la apertura de los canales de calcio, que provoca la exocitosis [9].

Se sabe que en presencia de cinc, la insulina puede formar tetrámeros y hexámeros que fijan el cinc con una relación de insulina : cinc de 4:1 a 6:2, respectivamente. La insulina se almacena en los gránulos de secreción en forma de un sólido compuesto de hexámeros unidos a 2 átomos de cinc por hexámero. Las vesículas contienen cinc en un exceso de 1 a 1,5 veces la cantidad necesaria para formar los hexámeros de insulina-cinc. Durante la exocitosis de la insulina, las vesículas ricas en insulina se fusionan con la membrana plasmática de la célula beta y liberan la insulina, pero también cinc, a la circulación. El cinc liberado actúa en un bucle de retrocontrol negativo sobre los canales de potasio, provocando su activación y la detención de la exocitosis.

En las células de mamíferos, se han clonado y caracterizado 7 proteínas homólogas que tienen una función transportadora... [Seguir leyendo]

1. El uso de un producto seleccionado entre: (i) una proteína que comprende o consiste en la proteína ZnT-8 de secuencia SEC ID Nº: 2, (ii) un fragmento de al menos 15 aminoácidos consecutivos de ZnT-8, y (iii) una microplaca de proteína realizada con una proteína, como se define en (i) o un fragmento como se define en (ii), para detectar, en el suero de un individuo, la presencia de anticuerpos dirigidos contra las células beta de los islotes de Langerhans.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que se selecciona un fragmento de ZnT-8 entre los polipéptidos de las secuencias SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 10, para detectar, en el suero de un individuo, en el suero de un individuo la presencia de anticuerpos dirigidos contra las células beta de los islotes de Langerhans

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que se utiliza una microplaca de proteína que comprende un fragmento de ZnT-8, seleccionado entre los polipéptidos de las secuencias SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 10 para detectar, en el suero de un individuo, la presencia de anticuerpos dirigidos contra las células beta de los islotes de Langerhans.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la presencia de anticuerpos dirigidos contra las células beta de los islotes de Langerhans se detecta por un procedimiento inmunoquímico y/o por un procedimiento inmunoenzimático.