PROCEDIMIENTOS PARA LA EXTRACCION DE PROLAMINAS TOXICAS DEL GLUTEN ENCELIAQUIA.

Procedimientos para la extracción de prolaminas tóxicas del gluten en celiaquía. Campo de la invención Esta invención se refiere de forma general al análisis de alimentos, procesados y no procesados por calor, para determinar su contenido en gluten (gliadinas y gluteninas), y más específicamente a un procedimiento para extraer el gluten (gliadinas y gluteninas) de productos alimenticios, compatible con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que permite detectar el gluten hidrolizado y no hidrolizado (gliadinas y gluteninas). Antecedentes de la invención La celiaquía es una enfermedad inflamatoria del intestino delgado superior y resulta de la ingestión de gluten en individuos genéticamente susceptibles, siendo la única enteropatía inducida por nutrientes que dura toda la vida. La celiaquía se desencadena en individuos susceptibles por la ingestión de prolaminas de gluten de trigo, cebada, centeno y posiblemente avena, lo que provoca cambios histológicos en la mucosa del intestino delgado, conduciendo a un síndrome de intolerancia [1]. Se conoce desde 1953 que la afección se agrava cuando los pacientes comen alimentos que contienen harina de trigo y que ulteriormente también estaban implicados el centeno y la cebada, un cruce artificial entre trigo y centeno, denominado triticale y, posiblemente, la avena. El único tratamiento para la celiaquía es una dieta estricta sin gluten. Cuanto menos sigan los individuos esta dieta, mayor es la posibilidad de desarrollar malnutrición y otras complicaciones. Sin embargo, todos los problemas revierten cuando se establece una dieta estricta sin gluten [2]. El gluten es el contenido en proteínas del trigo, centeno, avena, cebada y maíz, y puede dividirse en glutenina y gliadina (fracción soluble en alcohol). Las gluteninas son insolubles en agua o alcohol pero pueden volverse solubles una vez que se reducen los puentes disulfuro intercatenarios. Pueden dividirse adicionalmente en fracciones de alto peso molecular (HMW) y bajo peso molecular (LMW) y la gliadina puede subdividirse en fracciones , y , en base a sus secuencias de aminoácidos N-terminales. Las proteínas correspondientes en centeno, cebada y avena se conocen como secalinas, hordeínas y aveninas, respectivamente. Los pacientes celíacos presentan un amplio rango de sensibilidad a la ingestión de gluten, con manifestaciones clínicas a cantidades mínimas de gliadina observadas [3], Por consiguiente, para certificar productos sin gluten, es obligatorio el uso de ensayos altamente sensibles. La Unión Europea, la Organización Mundial de la Salud y el Codex Alimentarius exigen una medición fiable de la prolamina del trigo, la gliadina (así como de las prolaminas de otros cereales), más que de todas las proteínas derivadas del trigo, que incluyen albúminas, globulinas y proteínas de los gránulos de almidón [4], Un problema importante en la producción de materias primas sin gluten, y en la producción de alimento sin gluten, es la contaminación durante el procesado. Con bastante frecuencia, ingredientes y productos que comenzaron su vida libres de gluten, se contaminan y se vuelven peligrosos para el consumo en personas celíacas. Los límites oficiales descritos en el Codex Draft Revised Standard (Norma revisada del borrador del código) (2000) son de 20 ppm para los productos alimenticios libres de gluten por naturaleza, 200 ppm para productos alimenticios que se han convertido en libres de gluten, productos alimenticios sólidos a base de materia seca y productos alimenticios líquidos partiendo de la base del producto original. El progreso en el desarrollo de un procedimiento fiable de análisis para determinar el gluten es difícil. Los kits disponibles actualmente para la medición del gluten: - son ensayos tipo sándwich indirectos que llevan mucho tiempo [5-8], - no pueden detectar la gliadina de manera equivalente en los diversos cereales [5, 7], - no son específicos para la gliadina tóxica en la celiaquía [8, 9], - no detectan las formas hidrolizadas de gliadina [6, 10] y - se destruyen por los agentes reductores empleados comúnmente en la extracción del gluten del alimento (que desnaturalizan anticuerpos y marcadores enzimáticos) [7, 10]. Por tanto, a lo largo de los últimos años no ha existido un procedimiento fiable para medir el contenido en gluten de artículos alimenticios. En la actualidad, el gluten se mide mediante procedimientos dependientes de epítopos, tales como ELISA, que usan anticuerpos monoclonales o policlonales. Una técnica ELISA útil para cuantificar el contenido en gluten de productos alimenticios se describe en Bermudo et al (2005) (56). 2 ES 2 349 915 A1 Tradicionalmente, se creía que la fracción de gliadina del gluten de trigo era la tóxica. Existía poca información concerniente a las gluteninas, debido a las dificultades en su separación y purificación. Pruebas recientes sugieren que ciertos péptidos de la glutenina y subunidades de las gluteninas recombinantes pueden estimular las células T del intestino delgado celíaco aisladas in vitro [11]. La consecuencia es que éstas son tóxicas in vivo. Sin embargo, los datos in vivo están restringidos en la actualidad a un artículo [12]. Este estudio mostraba un efecto tóxico in vivo en 4 de 4 pacientes celíacos expuestos a una mezcla de cuatro subunidades de glutenina de alto peso molecular (HMW). En la actualidad hay pocos datos disponibles concernientes a la toxicidad de las gluteninas de bajo peso molecular, sin embargo debe considerarse como posible que estas proteínas sean también tóxicas. Las gliadinas se extraen fácilmente de productos alimenticios crudos usando etanol, pero esto da como resultado sólo una extracción conjunta de un pequeño porcentaje de gluteninas, y se requiere una extracción más intensa que implica el uso de agentes reductores para solubilizar las gluteninas. Esto se debe a que las gluteninas son polímeros que no se extraen fácilmente hasta que se rompen los puentes disulfuro intercatenarios. Además, estas condiciones se requieren también para la extracción de gliadinas y gluteninas de alimentos cocinados. Cuando se calientan las gliadinas, las moléculas de azufre presentes en las gliadinas alfa y gamma, pero no en las omega, forman puentes disulfuro, de modo que la mayoría de las gliadinas se convierten en polímeros con los mismos problemas de solubilidad que las gluteninas. De modo que los procedimientos rutinarios para la extracción de gluten de productos alimenticios procesados por calor se basan en el uso de alcoholes, tales como etanol y propanol mezclados con agentes reductores tales como mercaptoetanol, ditiotreitol, agentes disociantes tales como urea, dodecilsulfato de sodio, clorhidrato de guanidina y mezclas de estos. Las composiciones resultantes usadas para la extracción son tóxicas, inflamables, inestables y tienen un olor acre. Por tanto, a la luz del descubrimiento reciente de que las gluteninas HMW también agravan la celiaquía, es esencial tener un protocolo universal que pueda usarse para extraer gliadinas y gluteninas de alimentos crudos y procesados. Se han llevado a cabo diversos protocolos de extracción para la extracción de gliadinas y gluteninas de productos alimenticios. Se ha usado comúnmente etanol, al 50-70% v/v [13-21] y propanol, al 50-70% v/v [18-27] para la extracción de gliadinas. También se ha usado cloruro de litio para la extracción de gliadinas [28], así como dimetilsulfóxido (DMSO) [21, 29, 30] y dimetilformamida [21, 31]. Siguiendo el protocolo de Osborne, que implica la extracción secuencial de las diferentes proteínas presentes en el gluten, se han extraído gluteninas con agentes reductores, tales como mercaptoetanol (al 1-2% p/v) [21, 25, 32] y ditiotreitol (al 0,1-2% p/v) [18, 19, 22, 24, 26, 27, 33-37], ácido acético (al 0,7% p/v) [25, 27, 38] y agentes disociantes tales como urea (2-8 M) [21, 26, 31, 35], clorhidrato de guanidina (2-6 M) [39] y SDS (al 1-2%) [39, 40]. Básicamente, los procedimientos de extracción usados eran los mismos, que implicaban agitación rápida con vórtex y un periodo de extracción (que oscila entre 15 minutos y 120 minutos), seguido de centrifugación (durante un periodo de 15 minutos a 60 minutos), normalmente a temperatura ambiente, aunque hay algunos informes en los que se eleva la temperatura hasta 60ºC [22, 25, 35, 37]. En las extracciones se empleó un tampón, como Tris(hidroximetil)aminometano (Tris) (0,05 M-0,08 M, pH 7,5-8,0), tampón borato (0,05 M, pH 8,5) o tampón fosfato de sodio (0,05 M), a pH 7,8. Diversos informes han detallado el uso de una mezcla de agentes reductores y agentes disociantes. En un ejemplo, se usó tampón Tris más un agente disociante (urea 8M, clorhidrato de guanidina 6M o SDS al 2% p/v) ajustado hasta pH 7,5 con ácido nítrico para la extracción de gluteninas [13]. Las gluteninas se redujeron entonces...

1. Composición que consiste en Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) como agente reductor para la reducción irreversible de puentes de disulfuro y un disolvente con alto punto de ebullición, superior a 100ºC, y/o alta constante dieléctrica, superior a 35 a temperatura ambiente, en un tampón con un pH entre 4 y 9. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que la Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) está a una concentración superior a 0,1 mM. 3. Composición según la reivindicación 1, en la que el disolvente se selecciona de entre DMF, DMSO o glicerol, con una concentración comprendida entre el 30-70% v/v. 4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que consiste en TCEP, como agente reductor, un disolvente seleccionado de entre glicerol, DMSO o DMF, en tampón HEPES o PBS, con un pH entre 4 y 9. 5. Uso de una composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la extracción simultánea de gliadinas y gluteninas de muestras de alimento, procesados o no procesados por calor. 6. Procedimiento para la extracción simultánea de gliadinas y gluteninas, en muestras de alimento, procesados o no procesados por calor, que comprende a) mezclar la muestra de alimento con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y b) incubar la mezcla resultante a una temperatura superior a 50ºC, durante un periodo de tiempo superior a 2 minutos. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende repetir este procedimiento en un intervalo de 2 a 10 veces. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que, antes de la extracción, se lleva a cabo una etapa de desengrasado. 9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa de desengrasado se lleva a cabo usando acetona. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que, tras la extracción, se lleva a cabo una etapa de cuantificación de las gliadinas y gluteninas extraídas usando ELISA. 11. Kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 12. Kit según la reivindicación 11, que comprende además los reactivos necesarios para realizar un ELISA para cuantificar el contenido en gliadinas y gluteninas de ambas muestras de alimento, procesado por calor y no procesado por calor. 19 ES 2 349 915 A1 ES 2 349 915 A1 21 ES 2 349 915 A1 22 ES 2 349 915 A1 23 ES 2 349 915 A1 24 ES 2 349 915 A1 ES 2 349 915 A1 26 ES 2 349 915 A1 27 ES 2 349 915 A1 28 ES 2 349 915 A1 29 ES 2 349 915 A1 ES 2 349 915 A1 31 ES 2 349 915 A1 32 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA