Un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un paciente infectado por VIH que comprende medir el nivel de fosforilación de la cofilina en una muestra procedente de dicho paciente

ANTECEDENTES

La infección por VIH de células susceptibles, tales como los linfocitos T CD4+, está mediada por la interacción del CD4 y un correceptor de quimiocinas de la superficie celular con la proteína de envoltura gp120. La partícula vírica del VIH se une inicialmente a través de su proteína de envoltura gp120 al receptor CD4 de la célula objetivo. Se produce un cambio conformacional en la gp120 que da como resultado su subsiguiente unión a un receptor de quimiocinas, tal como el receptor CCR5. Véase, por ejemplo, Wyatt y col., Science, 280: 1884-1888 (1998). Las cepas víricas de VIH-1 que se originan subsiguientemente en la infección se unen al receptor de quimiocinas CXCR4.

El VIH no se replica inmediatamente en todas las células infectadas, sino que puede progresar hasta un estado de infección latente, en la que el VIH está inactivo. Tras la activación de una célula latente infectada, por ejemplo mediante la unión a los CD3 y CD28 de la superficie del linfocito T, el virus de VIH "inactivo" puede activarse, iniciando el proceso de replicación vírica. La replicación del VIH da como resultado la producción de partículas infecciosas de VIH, que facilitan la propagación de la infección por todas las células del sujeto.

El conjunto de células infectadas de forma latente en el compartimento de los linfocitos T CD4+ en reposo está considerado como uno de los principales impedimentos para la erradicación del VIH. Cuando están infectados de forma latente, y los linfocitos T en reposo se activan, las partículas víricas liberadas durante el proceso de reactivación pueden propagarse e infectar a los linfocitos T en reposo, así como a los linfocitos T CD4+ activados. Este proceso de reactivación puede facilitar el continuo reabastecimiento del reservorio de los linfocitos T CD4+, contrarrestando los beneficios de un tratamiento antivírico, tal como HAART, y contribuyendo a la persistencia del VIH y al inicio de nuevos ciclos de infección. Véase, por ejemplo, Chun y col., J. Clin. Invest. 115: 3250-3255, 2005.

Consecuentemente, son necesarios procedimientos capaces de detectar

y tratar la infección por VIH durante esta fase latente.

RESUMEN

En un aspecto, se prevé un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un paciente infectado por VIH que comprende la medición del nivel de fosforilación de la cofilina en una muestra de un paciente. En una forma de realización, el nivel de fosforilación se mide en el residuo de serina-3 de la cofilina. En otra forma de realización, la medición se realiza detectando un cambio conformacional provocado por la fosforilación en el transporte de electrones regulado por la fosforilación en el residuo de serina-3 de la cofilina.

En otra forma de realización, en la que se mide el nivel de fosforilación del residuo de serina-3 de la cofilina, el nivel de fosforilación puede medirse usando un anticuerpo anti-fosfo-cofilina ser3. Esta medición del nivel de fosforilación puede comprender la proporción entre la cofilina fosforilada y la cofilina, o dicha medición puede comprender la proporción entre la cofilina fosforilada y la cofilina activa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIGURA 1: la gp120 del VIH-1 media en la despolimerización de la actina cortical en linfocitos T CD4 en reposo.

FIGURA 2: la señalización mediante gp120-CXCR4 del VIH desencadena la despolimerización de la actina sensible a la toxina tosferínica.

FIGURA 3: inhibición de la infección latente por VIH-1 por Jas. (A) Efectos del Jas sobre la activación del LFA-1.

FIGURA 4: efectos de la Lat-A sobre la despolimerización de la actina y la replicación del VIH-1 en linfocitos T CD4 en reposo.

FIGURA 5: la señalización mediante gp120-CXCR4 del VIH desencadena la activación de la cofilina sensible a VIH.

FIGURA 6: la inducción de la cofilina activa promueve la infección vírica

latente de los linfocitos T en reposo.

FIGURA 7: fraccionamiento de la actina citoesquelética de los linfocitos T CD4 tratados con gp 120.

FIGURA 8: microscopía confocal de la distribución de CD4 y CXCR4 en linfocitos T CD4 latentes tratados con Jas 120 nM .

FIGURA 9: inhibición de la secreción de IL-2 por la estaurosporina.

FIGURA 10: inhibición de la activación de los linfocitos T y la replicación vírica por la estaurosporina.

FIGURA 11: activación de la cofilina en pacientes seropositivos para VIH.

FIGURA 12: vía de señalización para la activación de la cofilina.

FIGURA 13: cribado de inhibidores del VIH. El inhibidor JNK II inhibe la cinasa C-jun-N-terminal. CA significa caliculina A, un inhibidor de la fosfatasa PP1a y PP2A. SB90 significa SB 202190, un inhibidor de la p38 Map cinasa. SB74 significa SB 202474, un control negativo de SB 90. FK 506 inhibe PP2B/Calcineurina. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

FIGURA 14: cribado de inhibidores del VIH. La genisteína es un inhibidor de la tirosina cinasa. PD59 es un inhibidor de la MAP cinasa cinasa. FK506 es un inhibidor de la calcineurina. Wortmannin es un inhibidor de PI3K. LY294002 es un inhibidor de PI3K. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

FIGURA 15: cribado de inhibidores del VIH. PP2 es un inhibidor de la tirosina cinasa de la familia Src. PP3 es un control negativo de PP2. AG1478 es un inhibidor de la EGFR cinasa. AG1296 es una cinasa del receptor PDGF. El control es una célula infectada por VIH sin fármacos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La infección por VIH puede detectarse midiendo eventos de la cascada de transducción de señales, tal como evaluando los niveles de fosforilación de los miembros de la familia del factor despolimerizante de la actina (actinadepolymerizing factor, ADF)/cofilina. Por ejemplo, la infección por VIH de linfocitos T en reposo da como resultado una activación de la cofilina mediante la desfosforilación en la serina-3. Por lo tanto, puede usarse un control del estado desfosforilación de la cofilina para detectar el VIH en muestras de pacientes y para controlar la progresión de la enfermedad.

Todos los términos técnicos de esta descripción son los usados habitualmente en bioquímica, biología molecular e inmunología, respectivamente, y pueden ser comprendidos por los expertos en la materia en el campo de esta invención. Estos términos pueden encontrarse en: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel y col., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periódicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5ª ed., vol. 1-2, ed. Ausubel y col., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997; CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 4ª ed. Abbas y col., WB Saunders, 1994.

DEFINICIONES

La cofilina se refiere a una secuencia proteica que controla reversiblemente la polimerización y despolimerización de la actina de una forma sensible al pH. La cofilina tiene la capacidad de unirse a la actina G y F en una proporción de 1:1 entre la cofilina y la actina. Según se usa en este documento, cofilina se refiere a la molécula de cofilina funcionalmente activa que no está fosforilada y que es capaz de alterar el citoesqueleto celular. Algunos ejemplos de polinucleótidos y secuencias polipeptídicas de cofilina se establecen en las ID SEC Nº: 1 y 2, respectivamente.

La "vía del correceptor del VIH" incluye los correceptores del VIH (por ejemplo, CXCR4, CCR5, etc.) que se usan para que el virus entre en las células, y miembros corriente abajo de su vía de señalización. Dichos miembros incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, proteínas G; JAK1, JAK2, JAK3; tirosina cinasas, tales como MEK1 y/o MEK2; Rac1/PAK1/LIMK; cofilina; fosfatasas, tales como PP1, PP2A, bSSK y/o cronofina; etc. Un miembro de la vía de señalización del correceptor también puede describirse como un efector de la estimulación del correceptor, es decir, que es modulado tras la estimulación del correceptor por la proteína de envoltura del VIH.

I. DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN...

1. Un procedimiento para controlar la progresión de la enfermedad en un

paciente infectado por VIH que comprende medir el nivel de fosforilación de la 5 cofilina en una muestra procedente de dicho paciente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de fosforilación se mide en el residuo serina-3 de la cofilina.

10 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha medición se realiza detectando un cambio conformacional provocado por la fosforilación sobre el transporte de electrones regulado por la fosforilación en el residuo de serina-3 de la cofilina.

15 4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el nivel de fosforilación se mide usando un anticuerpo anti-fosfo-ser3 de cofilina.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha medición

comprende la proporción entre cofilina fosforilada y cofilina. 20

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha medición comprende la proporción entre cofilina fosforilada y cofilina activa.