Procedimiento enzimático para la acilación en posición 3- del resveratrol.

Procedimiento enzimático para la acilación regioselectiva del resveratrol en su posición 3-, utilizando un éster vinílico y lipasas fúngicas y bacterianas específicas, inmovilizadas, como biocatalizador. Las lipasas utilizadas en dicho procedimiento, proceden de bacterias u hongos que se seleccionan de entre Alcaligenes, Pseudomonas o Thermomyces

Procedimiento enzimático para la acilación en posición 3- del resveratrol.

La presente invención se refiere a un procedimiento enzimático de acilación regioselectiva en posición 3 del resveratrol y en un solo paso utilizando un éster vinílico y una lipasa inmovilizada como biocatalizador. Dadas las variadas aplicaciones de los antioxidantes, la invención puede englobarse dentro del campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector farmacéutico, industrias de alimentos funcionales, nutracéuticos o cosméticos.

Estado de la técnica

En los últimos años, diferentes estudios han evidenciado el efecto beneficioso para la salud que se deriva de la ingesta de alimentos de origen vegetal (frutas, hortalizas, aceite de oliva virgen, vino tinto, té, etc). Las propiedades saludables que ejercen estos alimentos van más allá de las que cabría esperar por sus nutrientes, vitaminas y sales minerales, por lo que se ha postulado que se deben a los metabolitos secundarios que contienen, ocupando un lugar destacado entre éstos los polifenoles. De las diferentes actividades biológicas de los polifenoles, la antioxidante es la que ha suscitado mayor interés puesto que los antioxidantes se usan para contrarrestar los efectos de los procesos oxidativos in vivo, que se han relacionado entre otros con algunas enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, cáncer o incluso del envejecimiento (Y.Z. Fang et al., "Free radicals, antioxidants, and nutrition", Nutrition 2002, vol. 18, pp. 872-879).

Entre los compuestos polifenólicos es muy destacable el caso del resveratrol (trans-3,5,4'-trihidroxiestilbeno), producto natural presente en la uva. Se ha descrito que el resveratrol puede interferir de manera crítica en multitud de eventos asociados al desarrollo de enfermedades degenerativas, incluyendo las cardiovasculares y el cáncer (A.R. Martin et al., "Resveratrol, a polyphenol found in grapes, suppresses oxidative damage and stimulates apoptosis during early colonic inflammation in rats", Biochem. Pharmacol. 2004, vol. 67, pp. 1399-1410; J.M. Wu et al., "Mechanism of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present in red wine (Review)", Int. J. Mol. Med. 2001, vol. 8, pp. 3-17).

En general, las propiedades deseables en los compuestos antioxidantes para ser empleados como aditivos promotores de la salud son: capacidad captadora de radicales libres, estabilidad y biodisponibilidad. El principal problema del uso de los compuestos fenólicos es su baja estabilidad y/o la modificación que sufren in vivo en procesos de detoxificación, donde las agrupaciones más antioxidantes, como por ejemplo la orto-dihidroxílica, son bloqueadas. Por tanto, es necesario encontrar compuestos que sean suficientemente estables tanto a temperatura ambiente como a la temperatura del organismo, y que sean funcionales el tiempo suficiente antes de ser degradados y/o metabolizados. Una de las aproximaciones que se ha utilizado para aumentar la estabilidad del resveratrol, sin disminuir su actividad biológica, es la preparación de derivados modificados con un resto glicosilo o con una cadena lipofilica (V. Cardile et al., "Chemoenzymatic synthesis and cell-growth inhibition activity of resveratrol analogues", Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp. 22-33; F. Orsini et al., "Isolation, synthesis, and antiplatelet aggregation activity of resveratrol 3-O-β-D-glucopyranoside and related compounds", J. Nat. Prod. 1997, vol. 60, pp. 1082-1087; y G. Regev-Shoshani et al., "Glycosylation of resveratrol protects it from enzymic oxidation", Biochem. J. 2003, vol. 374, pp. 157-163).

Por otro lado, resulta muy interesante intentar modular la biodisponibilidad de los antioxidantes por la adición de una cadena lipofilica, estrategia que permite de manera sencilla modificar su balance hidrófilo-lipófilo. Estos derivados acilados mantienen la estabilidad del antioxidante, son solubles en medios grasos y además suelen ser muy permeables en modelos de células de piel humana (A. Tai et al., "Permeation and metabolism of a series of novel lipophilic ascorbic acid derivatives, 6-O-acyl-2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acids with a branched-acyl chain, in a human living skin equivalent model" Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, vol. 14, pp. 623-27). Dichas modificaciones pueden ejercer un papel crítico en cuanto a tiempo de residencia en el organismo, grado de metabolismo, eficacia en la absorción, y en definitiva, efectividad como nuevos posibles antioxidantes.

Además, modificaciones químicas mínimas en el núcleo estilbeno del resveratrol pueden causar grandes cambios en su actividad biológica y, más concretamente, en sus propiedades antitumorales (R. Chillemi et al., "Anti-tumor properties of stilbene-based resveratrol analogues: Recent results", Nat. Prod. Commun. 2007, vol. 2, pp. 499-513). Así, algunos derivados de resveratrol con cadenas acilo han mostrado mayor inhibición sobre el crecimiento celular de células de cáncer de próstata DU-145 que el propio resveratrol (V. Cardile et al., "Chemo-enzymatic synthesis and cell-growth inhibition activity of resveratrol analogues", Bioorg. Chem. 2005, vol. 33, pp.22-33).

Es, por tanto, deseable disponer de procedimientos sencillos para la lipofilización de antioxidantes naturales para otorgarles mayor estabilidad y/o biodisponibilidad. La lipofilización por métodos enzimáticos (generalmente empleando el catalizador enzimático en forma inmovilizada sobre soportes que incrementan su resistencia mecánica y térmica) ofrece rendimientos y selectividades muy notables, lleva implícitas mejoras medioambientales, y ofrece la posibilidad de trabajar en condiciones suaves de operación (temperaturas bajas y presión atmosférica) lo que disminuye el consumo energético, dando lugar a una importante reducción de los costes. Debido al enorme interés de los derivados de antioxidantes naturales como sustancias terapéuticas, ingredientes funcionales, nutracéuticos o agentes cosméticos, se han postulado los métodos enzimáticos como una alternativa "sostenible" para la producción de los mismos.

Cuando se hace reaccionar un compuesto polifenólico con un donador de acilo en presencia de una enzima, la posición o posiciones de acilación pueden variar sustancialmente en función del biocatalizador ensayado, pudiendo, en principio, tener lugar sobre cualquiera de los grupos OH fenólicos. Así, en el caso del resveratrol, que presenta tres grupos fenólicos (en las posiciones 3-, 4'- y 5- del núcleo estilbeno) con una reactividad química similar, se ha descrito que la reacción con acetato de vinilo en presencia de la lipasa B de Candida antarctica da lugar selectivamente a 4'-O-acetil-resveratrol con un rendimiento del 50% (R.W. Teng et al., "Regioselective acylation of several polyhydroxylated natural compounds by Candida antarctica lipase", Biocatal. Biotransform. 2005, vol. 23, pp. 109-116). No obstante, al aumentar la longitud de cadena del ácido graso la velocidad de reacción disminuye notablemente. Sin embargo, es difícil obtener una esterificación enzimática selectiva en el grupo fenólico en posición 3- (equivalente a la posición 5- al tratarse de una molécula simétrica) debido probablemente a las dificultades de acilar selectivamente el grupo fenólico más impedido estéricamente en la molécula. La obtención de este producto acetilado en posición 3- está descrita mediante una esterificación quimioenzimática. En ese caso se realiza inicialmente una peracetilación química, seguida de una alcohólisis regioselectiva catalizada por la lipasa B de Candida antarctica. Con este mismo procedimiento también se obtiene el diacetato de resveratrol en los grupos fenólicos de las posiciones 3,5- a tiempos más cortos de reacción (G. Nicolosi et al., "Chemo-enzymatic preparation of resveratrol derivatives", J. Mol. Catal. B Enzym. 2002, vol. 16, pp. 223-229).

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a la modificación enzimática del antioxidante, natural o sintético, resveratrol mediante acilación regioselectiva en la posición 3-, utilizando un éster vinílico, preferiblemente de ácidos grasos de distinta longitud de cadena. Concretamente las enzimas utilizadas, como biocatalizadores, son lipasas inmovilizadas. La acilación con ácidos grasos puede minimizar la oxidación y fotodestrucción del resveratrol, aumentar su tiempo de vida y mejorar su biodisponibilidad., además de aumentar sus propiedades biológicas (por ejemplo, como antitumoral).

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de acilación del resveratrol, caracterizado porque comprende la incubación de resveratrol con un éster vinílico en presencia de una lipasa inmovilizada, donde dicha lipasa procede de bacterias o de hongos que se seleccionan de la lista que comprende Alcaligenes, Pseudomonas o Thermomyces.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el éster vinílico es acetato de vinilo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el éster vinílico es un éster vinílico de un ácido graso (C₄-C₂₆).

4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde el éster vinílico es un éster vinílico de un ácido graso (C₁₆-C₂₂).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la lipasa procede de una bacteria de la especie Alcaligenes sp.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la lipasa procede de una bacteria de la especie Pseudomonas cepacia.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la lipasa procede de un hongo de la especie Thermomyces lanuginosus.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la lipasa se encuentra inmovilizada en tierra de diatomeas.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el resveratrol se disuelve previamente a la incubación en un disolvente de polaridad media.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde el disolvente de polaridad media se selecciona de la lista que comprende 2-metil-2-butanol, tert-butanol, éter isopropílico o 2-pentanona.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la incubación se realiza a una temperatura de entre 25ºC y 65ºC.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la incubación se realiza a una temperatura de entre 30ºC y 50ºC.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la incubación se realiza con agitación.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde la agitación es orbital y de entre 100 rpm y 250 rpm.