PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA VARIANTE DEL ANTÍGENO PROTECTOR DE SUPERFICIE DE ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE EN E. COLI.

Un procedimiento para preparar una variante de la proteína SpaA del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae o de una forma reducida de la misma,

la proteína ΔSpaA, donde al menos aproximadamente 1/3 del extremo C de la proteína SpaA es suprimido, teniendo dicha variante inmunogenicidad y siendo expresada en E. coli en forma de cuerpos de inclusión, que comprende mutar un gen que codifica dicha proteína SpaA o ΔSpaA de manera que se pueda introducir una sustitución de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína SpaA o ΔSpaA, permitiendo que el gen mutado resultante sea expresado en E. coli, y seleccionando dicha variante que formaba cuerpos de inclusión entre las variantes expresadas, donde dicha sustitución de aminoácido es una o una combinación de más de una seleccionada del grupo que consiste en (1) a (7) descritos más abajo: (1) el 69 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; (2) el 154 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; (3) el 203 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina; (4) el 214 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina; (5) el 253 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina; (6) el 278 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; y (7) el 531 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; o donde dicha sustitución de aminoácido es una seleccionada del grupo que consiste en (a) a (h) descritos más abajo: (a) el 69 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; (b) el 203 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina; (c) el 214 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina; (d) el 278 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; (e) el 531 o aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; (f) el 154 o y el 203 o aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina y treonina, respectivamente; (g) el 214 o y el 253 o aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glutamina y treonina, respectivamente; y (h) el 69 o , el 154 o y el 203 o aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina, glicina y treonina, respectivamente.

La presente invención hace referencia a un procedimiento para preparar una variante del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae (también referido en adelante como "SpaA") con Escherichia coli como anfitrión. Más concretamente, la presente invención hace referencia a un procedimiento para preparar una variante de SpaA o una forma reducida de SpaA (también referida en adelante como "ΔSpaA"), donde al menos aproximadamente 1/3 del extremo C de la proteína SpaA es suprimido, con la introducción de una sustitución de aminoácidos como se define en las reivindicaciones, donde dicha variante puede ser expresada como cuerpos de inclusión insolubles cuando es expresada dentro de las células de E. coli, y a una variante de una proteína SpaA o ΔSpaA recombinante obtenida por medio de dicho procedimiento.

La erisipela porcina es una enfermedad de suídos causada por la infección con Erysipelothrix rhusiopathiae donde el súido infectado padece síntomas tales como sepsis en los casos agudos, pápulas en los casos subagudos, o endocarditis y artritis en los casos crónicos. Se ha informado de que alrededor de 3.000 súidos al año tienen la enfermedad, lo que representa un perjuicio enorme para un ganadero. Erysipelothrix rhusiopathiae es patógeno para animales de consumo tales como jabalíes salvajes, ballenas, pollos y pavos, además de súidos y está especificado como una de las enfermedades infecciosas a supervisar en el Protective Act of Livestock Diseases. La erisipela porcina también es una zoonosis que ocasiona erisipeloide en seres humanos y tiene importancia desde el punto de vista de la higiene de la carne. Existen numerosos serotipos de Erysipelothrix rhusiopathiae, de los cuales los serotipos 1 y 2 causan la mayor parte de las erisipelas porcinas en súidos.

Para la protección frente a infecciones de erisipela porcina, se han utilizado hasta ahora vacunas vivas atenuadas, esto es, vacunas vivas liofilizadas preparadas utilizando la cepa Koganei que es una cepa atenuada de Erysipelothrix rhusiopathiae preparada subcultivando Erysipelothrix rhusiopathiae virulento en un medio con un suplemento de acriflavina durante un período prolongado; las vacunas inactivadas, esto es, las vacunas de bacterias preparadas tratando un cultivo de Erysipelothrix rhusiopathiae virulento con formalina y haciendo que todas las células y los productos extracelulares sean adsorbidos sobre gel de hidróxido de aluminio; y las vacunas de componentes, esto es, aquellas que comprenden una fracción de proteínas de superficie no purificadas de las células extraídas de células completas con una solución acuosa de álcali. Se piensa que las vacunas vivas atenuadas son mucho menos costosas puesto que pueden ser eficaces con una única administración en una pequeña cantidad. No obstante, se indica que también resultan problemáticas ya que son patógenas en ratones induciendo artritis, muestran efectos secundarios graves en súidos con un bajo nivel de anticuerpo o súidos SPF, y la cepa de la vacuna se aísla de la lesión de súidos que padecen erisipela porcina.

En cuanto a un nuevo tipo de vacunas, están en marcha la investigación y el desarrollo de vacunas recombinantes por medio del uso de técnicas de recombinación genética. Galan y Timony inmunizaron ratones con un producto lisado de E. coli transfectado con un fago recombinante que expresa genes de una porción del genoma de Erysipelothrix rhusiopathiae y realizaron un ensayo de sensibilización con Erysipelothrix rhusiopathiae para observar que de 14 a 17% de los ratones inmunizados se libraron de morir después de la infección. Además, revelaron que las proteínas codificadas por los genes tenían un peso molecular de 66, 64, y 43 kDa a partir de su reactividad con un suero inmunitario contra el producto lisado y demostraron que estas proteínas podían ser antígenos protectores para la infección por Erysipelothrix rhusiopathiae (véase la referencia no de patente Núm. 1).

Makino et al. expresaron un gen que codificaba una proteína de superficie con un peso molecular de 64 kDa (denominada "SpaA") a partir de la cepa tama 96 de Erysipelothrix rhusiopathiae de tipo 2 en E. coli, inmunizaron ratones con las células vivas de E. coli recombinante resultantes, y realizaron un ensayo de sensibilización con Erysipelothrix rhusiopathiae para demostrar que la proteína SpaA tenía actividad protectora frente a la infección. También revelaron que la proteína SpaA tenía una secuencia de 606 residuos aminoácido donde, en el extremo N-terminal, se encuentra un péptido señal que consiste en 29 residuos aminoácido y en el extremo C-terminal se encuentran ocho secuencias de repetición homólogas que consisten en 20 aminoácidos exceptuando la 8ª repetición que consiste en 19 aminoácidos (véase la referencia no de patente 2).

Imada et al. investigaron la proteína SpaA de la cepa Fujisawa de tipo 1 correspondiente a la proteína SpaA anterior y un gen que codificaba dicha proteína para revelar que dicha proteína SpaA de la cepa Fujisawa de tipo 1 es una que tiene un peso molecular de 69 kDa que tiene una secuencia de 626 residuos aminoácido con una secuencias de repetición homóloga más, esto es, nueve, en su extremo C terminal, en comparación con la proteína SpaA de tipo 1, consistiendo la 9ª repetición en 19 aminoácidos. Demostraron que una proteína de fusión de SpaA completa, SpaA con una deleción de las secuencias de repetición homólogas en el extremo C terminal, o SpaA con una deleción de una porción de las secuencias N terminal y las secuencias de repetición homólogas del extremo C terminal, con un hexámero de histidina, mostraba un efecto protector frente a la infección (véanse las referencias no de patente 3 y 4).

Watanabe et al. también informaron de que un polipéptido de 46,5 kDa preparado suprimiendo las secuencias de repetición homólogas en el extremo C terminal y una secuencia señal de secreción en el extremo N terminal de la proteína SpaA de Erysipelothrix rhusiopathiae podría ser un antígeno protector para la infección (antígeno protector de 46,5 kDa; denominado "46,5 KPA")(véase, p. ej., la referencia de patente 1).

Por otra parte, se ha intentado promover la productividad de una proteína candidato para vacunas. Por ejemplo, existe un informe de que 46,5 KPA podía ser expresada satisfactoriamente para la secreción fuera de las células utilizando Brevibacillus choshinensis como célula anfitriona (véase, p. ej., la referencia de Patente 2). Con este sistema de expresión, aproximadamente el 50% de la proteína expresada se vuelve insoluble debido a su coagulación en el cultivo. De acuerdo con el informe, la purificación de dicho 46,5 KPA se realizó filtrando un cultivo con una membrana de ultrafiltración, suspendiendo la materia insoluble recuperada sobre la membrana en una solución alcalina, y recuperando 46,5 KPA. De este modo, este procedimiento de purificación requiere al menos tres etapas: (1) condensación por medio de ultrafiltración en condiciones de neutras a alcalinas suaves (pH 7 a 9,5); (2) recuperación de una fracción de filtración por medio de ultrafiltración en condiciones fuertemente alcalinas (pH 10,0 a 12,0); y (3) purificación de la fracción de ultrafiltración mediante cromatografía de intercambio iónico.

Cuando el gen de SpaA es expresado en E. coli, la mayor parte de la proteína puede ser expresada como una proteína soluble y por consiguiente puede no aplicarse el procedimiento de purificación para la materia insoluble, descrito más arriba. Un cultivo puede contener, además de la proteína SpaA de interés, diferentes contaminantes tales como desechos celulares de E. coli, componentes de un medio de cultivo, productos metabólicos producidos durante el cultivo, etc. No es fácil recuperar y purificar eficazmente la proteína SpaA soluble de interés a partir de tales mezclas de contaminantes. Kesik et al. describen que se pueden utilizar los cuerpos de inclusión de bacterias recombinantes como un sistema novedoso para la liberación de antígenos para vacuna por la ruta oral (Kesik et al., Immunology Letters 91 (2004), 197-204). En general, una vacuna para animales, a diferencia de una vacuna para seres humanos, no sería aceptada por un ganadero a menos que tenga un precio bajo así como una elevada pureza y una elevada calidad. Por consiguiente, un fabricante de una vacuna para animales siempre requiere una mejora en el procedimiento de producción y un procedimiento de recuperación y purificación que permita un tratamiento a gran escala y una reducción del coste de producción.

referencia de Patente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una variante de la proteína SpaA del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae o de una forma reducida de la misma, la proteína ΔSpaA, donde al menos aproximadamente 1/3 del extremo C de la proteína SpaA es suprimido, teniendo dicha variante inmunogenicidad y siendo expresada en E. coli en forma de cuerpos de inclusión, que comprende mutar un gen que codifica dicha proteína SpaA o ΔSpaA de manera que se pueda introducir una sustitución de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína SpaA o ΔSpaA, permitiendo que el gen mutado resultante sea expresado en E. coli, y seleccionando dicha variante que formaba cuerpos de inclusión entre las variantes expresadas, donde dicha sustitución de aminoácido es una o una combinación de más de una seleccionada del grupo que consiste en (1) a

(7) descritos más abajo:

(1) el 69º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(2) el 154º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(3) el 203º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(4) el 214º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina;

(5) el 253º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(6) el 278º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; y

(7) el 531º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; o donde dicha sustitución de aminoácido es una seleccionada del grupo que consiste en (a) a (h) descritos más abajo:

(a) el 69º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(b) el 203º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(c) el 214º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina;

(d) el 278º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(e) el 531º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(f) el 154º y el 203º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina y treonina, respectivamente;

(g) el 214º y el 253º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glutamina y treonina, respectivamente; y

(h) el 69º, el 154º y el 203º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina, glicina y treonina, respectivamente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas (A) a (D):

(A) introducir una mutación en un gen que codifica la proteína SpaA o ΔSpaA del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae soluble de manera que se pueda introducir una sustitución de aminoácido;

(B) transformar las células de E. coli con un vector de expresión que contiene el gen mutado resultante;

(C) seleccionar las células de E. coli que formaron cuerpos de inclusión insolubles entre las células de

E. coli transformadas anteriores; y

(D) cultivar las células de E. coli seleccionadas para la recuperación de los cuerpos de inclusión en el interior de las células.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que después de la etapa (D) comprende adicionalmente las etapas (E) a (F):

(E) administrar los cuerpos de inclusión o los cuerpos de inclusión tratados con un agente solubilizante a un animal sensible a infección por Erysipelothrix rhusiopathiae y después atacar dicho animal con una cepa virulenta de Erysipelothrix rhusiopathiae; y

(F) observar la supervivencia o muerte del animal sensible a Erysipelothrix rhusiopathiae para evaluar de ese modo la presencia de actividad protectora (inmunogenicidad) frente a la infección por Erysipelothrix rhusiopathiae.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicho Erysipelothrix rhusiopathiae se selecciona del grupo que consiste en la cepa Fujisawa, la cepa Koganai, la cepa Tama 96, la cepa SE-9 y la cepa Shizuoka 63.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proteína SpaA o ΔSpaA antes de la introducción de dicha sustitución de aminoácido tiene la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2 o la secuencia representada en el SEQ ID NO: 2 con una deleción en su extremo C, respectivamente.

6. Una variante de la proteína SpaA o de una forma reducida de la misma, ΔpaA del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae donde al menos aproximadamente 1/3 del extremo C de la proteína SpaA es suprimido, donde la sustitución de aminoácido es una o una combinación de más de una seleccionada del grupo que consiste en (1) a (7) descritas más abajo:

(1) el 69º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(2) el 154º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(3) el 203º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(4) el 214º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina;

(5) el 253º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(6) el 278º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina; y

(7) el 531º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina, que es inmunogénica y se expresa en E. coli en forma de cuerpos de inclusión.

7. Una variante de la proteína SpaA o de una forma reducida de la misma, ΔSpaA del antígeno protector de superficie Erysipelothrix rhusiopathiae donde al menos aproximadamente 1/3 del extremo C de la proteína SpaA es suprimido, donde se introduce una sustitución de aminoácido que es una seleccionada del grupo que consiste en (a) a (h) descritos más abajo:

(a) el 69º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(b) el 203º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por treonina;

(c) el 214º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glutamina;

(d) el 278º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(e) el 531º aminoácido del extremo N terminal que abarca la secuencia señal es sustituido por glicina;

(f) el 154º y el 203º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina y treonina, respectivamente;

(g) el 214º y 253º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glutamina y treonina, respectivamente; y

(h) el 69º, 154º y 203º aminoácidos del extremo N terminal que abarca la secuencia señal son sustituidos por glicina, glicina y treonina, respectivamente, que es inmunogénica y se expresa en E. coli en forma de cuerpos de inclusión.

8. La variante de la reivindicación 6 o 7 que se prepara mutando un gen que codifica la proteína SpaA o ΔSpaA para introducir una sustitución de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína SpaA o ΔSpaA, expresando el gen mutado de este modo en E. coli, y seleccionando entre las variantes expresadas aquellas que formaban cuerpos de de inclusión.

9. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 que se prepara mediante las siguientes etapas (A) a (D):

(A) introducir una mutación en un gen que codifica la proteína SpaA o ΔSpaA del antígeno protector de superficie de Erysipelothrix rhusiopathiae soluble de manera que se pueda introducir la sustitución de aminoácido;

(B) transformar las células de E. coli con un vector de expresión que contiene el gen mutado resultante;

(C) seleccionar las células de E. coli que formaban cuerpos de inclusión insolubles entre las células de E. coli transformadas anteriores; y

(D) cultivar las células de E. coli seleccionadas para la recuperación de los cuerpos de inclusión en el interior de las células.

10. La variante de la reivindicación 9, que se prepara mediante las siguientes etapas (E) a (F) posteriores a la etapa (D):

(E) administrar los cuerpos de inclusión o los cuerpos de inclusión tratados con un agente solubilizante a un animal sensible a infección por Erysipelothrix rhusiopathiae y después atacar dicho animal con una cepa virulenta de Erysipelothrix rhusiopathiae; y

(F) observar la supervivencia o muerte del animal sensible a Erysipelothrix rhusiopathiae para evaluar de ese modo la presencia de una actividad protectora (inmunogenicidad) frente a la infección por Erysipelothrix rhusiopathiae.

11. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que tiene la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2 o la secuencia representada en el SEQ ID NO: 2 con la deleción de su extremo C donde se introduce la sustitución de aminoácido.

12. La variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde dicha proteína SpaA o ΔSpaA deriva de una seleccionada del grupo que consiste en la cepa Fujisawa, la cepa Koganai, la cepa Tama 96, la cepa SE-9 y la cepa Shizuoka 63.

13. Una composición que comprende como ingrediente activo la variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

14. Un gen que codifica la variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

15. El gen de la reivindicación 14, que tiene una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos por deleción de una porción del extremo 3', que incluye una o una combinación de más de una sustitución de nucleótidos en el SEQ ID NO: 1 seleccionada del grupo que consiste en (1) a (7) descritas más abajo:

(1) el 206º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(2) el 461º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(3) el 608º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es C;

(4) el 642º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(5) el 758º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es C;

(6) el 833º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G; y

(7) el 1591º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G.

16. El gen de la reivindicación 14, que tiene una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos por deleción de una porción del extremo 3', que incluye cualquier sustitución de nucleótidos en el SEQ ID NO: 1 seleccionada del grupo que consiste en (a) a (h) descritas más abajo:

(a) el 206º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(b) el 608º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es C;

(c) el 642º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(d) el 833º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G; y

(e) el 1591º nucleótido de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 es G;

(f) el 461º y el 608º nucleótidos de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 son G y C, respectivamente;

(g) el 642º y el 758º nucleótidos de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 son G y C, respectivamente; y

(h) el 206º, el 461º y el 608º nucleótidos de la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1 son G, G y C, respectivamente.

17. El uso de la variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, para la preparación de una vacuna para la infección por Erysipelothrix rhusiopathiae.