MÉTODO PARA ELIMINAR POLÍMEROS DE SEROALBÚMINA HUMANA.

La presente invención se refiere a un método para eliminar un multímero de seroalbúmina humana. Más específicamente, la presente invención está relacionada con un método para eliminar un multímero de seroalbúmina humana que comprende la etapa de poner en contacto una disolución de seroalbúmina humana que contiene multímeros de seroalbúmina humana con un intercambiador aniónico en condiciones específicas. ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA La seroalbúmina humana (designada de aquí en adelante también como HSA) es un componente proteico importante presente en el plasma, consiste en un polipéptido monocatenario que comprende 585 restos aminoacídicos y tiene un peso molecular igual a aproximadamente 66.000 Da (véase Minghetti, P. P. et al. (1986), Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J. Biol. Chem. 261, pág. 6747-6757). Es conocido que los papeles principales de la HSA no son solo mantener la presión osmótica normal de la sangre, sino también unirse a una variedad de sustancias tales como iones de calcio, ácidos grasos, bilirrubina, triptófano y fármacos posiblemente presentes en la sangre, desempeñando así el papel de portador para transportar estas sustancias. La HSA purificada se ha usado, por ejemplo, en el tratamiento postoperatorio después de operaciones quirúrgicas y en el tratamiento de hipoalbuminemia causada por la pérdida de albúmina tal como en choque hemorrágico, quemaduras y síndromes nefróticos. Convencionalmente, la HSA se ha preparado sometiendo plasma humano al método de fraccionamiento con etanol a baja temperatura de Cone o a cualquier método similar al mismo, dando fracciones que contienen HSA (la HSA se fracciona en la fracción V) y purificando entonces la fracción mediante el uso de una variedad de técnicas de purificación. Además, se ha desarrollado recientemente un método en que no se usa plasma humano como material bruto, por ejemplo, una técnica para producir seroalbúmina humana usando células de levadura, Escherichia coli o Bacillus subtilis, haciendo uso de la técnica de recombinación génica. Estas técnicas de recombinación génica se detallan en (1) Production of recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et al. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1989, 11: 273-287, (2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken Okabayashi et al. J. Biochemistry, 1991, 110: 103-110, (3) Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz y Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology, 1991, 9: 1067-1072 para la levadura, (4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular, human serum albumin; Lawn, R. M. publicación de patente europea nº 0073646A (1983), (5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et al. Biotechnique, 1897, 5: 1309-1314 para Escherichia coli (E. coli), (6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et al. J. Bacteriol. 1987, 169: 2917-2925 para Bacillus subtilis. Los métodos para purificar la seroalbúmina humana utilizables en la presente memoria incluyen en general aquellos usados actualmente en la química de proteínas tales como el método de precipitación salina, el método de ultrafiltración, el método de precipitación isoeléctrica, el método de electroforesis, la técnica de cromatografía de intercambio iónico, la técnica de cromatografía de filtración en gel y/o la técnica de cromatografía de afinidad. Es más, la fracción que contiene seroalbúmina humana incluye diversas clases de contaminantes originados, por ejemplo, en tejidos biológicos, células y sangre y, por lo tanto, la seroalbúmina humana se ha purificado mediante una complicada combinación de los métodos anteriores. En la producción industrial de seroalbúmina humana, es inevitable tratar la misma en diversas condiciones diferentes de las condiciones ambientales observadas en el cuerpo humano y, en consecuencia, se forman multímeros de seroalbúmina humana. No es conocido todavía ningún informe de que estos multímeros afecten adversamente al cuerpo humano en la aplicación clínica de seroalbúmina humana, pero existe la sospecha de que estos multímeros pueden desarrollan una antigenicidad novedosa. Por esta razón, se prescribe un límite superior de contaminación con estos multímeros en el ensayo de estandarización de seroalbúmina humana como agente farmacéutico desde el punto de vista de la seguridad de la mismo como medicamento y, por lo tanto, se vuelve un problema importante reducir sustancialmente el contenido de dichos multímeros en la preparación en la producción de una preparación farmacéutica que contenga la misma. Dos o más moléculas de seroalbúmina humana se ligan entre sí formando dicho multímero de la misma; el punto isoeléctrico y las características químicas del último son correspondientemente bastante similares a los observados para el monómero y, por lo tanto, es muy difícil separar los multímeros de los monómeros según los métodos de purificación empleados en el proceso de producción habitual. Por esta razón, en las técnicas convencionales, se han eliminado los multímeros mediante una combinación de varios tipos de métodos de purificación seleccionados del grupo consistente en técnicas de cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, fraccionamiento isoeléctrico, fraccionamiento con sulfato de amonio y fraccionamiento con 2 E01978882 01-12-2011   etanol (véanse TOKUHYO Hei 11-509525 (publicación internacional de patente WO96/37515) y la patente japonesa nº 2.926.722 (registrada el 14 de mayo de Heisei 11 (1999)). Si se usa una pluralidad de métodos de purificación en combinación, la tasa final de recuperación es el producto de las conseguidas en las etapas de purificación usadas y, por lo tanto, la productividad resultante se reduce significativamente en la mayoría de casos. En consecuencia, se ha deseado el desarrollo de un método que pueda reducir el número de etapas de purificación lo más posible, que permita la eliminación eficaz de multímeros de la seroalbúmina humana y que permita la recuperación de monómeros de la misma con alto rendimiento desde el punto de vista industrial. DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar un método de una etapa para eliminar eficazmente los multímeros de seroalbúmina humana formados durante el proceso para la preparación de seroalbúmina humana. Es otro objeto de la presente invención proporcionar seroalbúmina humana que tenga una alta seguridad como medicamento. Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para purificar un monómero de seroalbúmina humana recombinante de una disolución que incluye un multímero de seroalbúmina humana recombinante que comprende (a) tratar la disolución a pH 9,0 durante más de 5 horas para convertir el multímero de seroalbúmina humana recombinante en monómeros y (b) cargar la disolución así tratada en un intercambiador aniónico equilibrado con un tampón que contiene una sal a una concentración en el intervalo de 10 a 100 mM y que tiene un valor de pH en el intervalo de 5,5 a 7,5, y recuperar una fracción pasada por el intercambiador aniónico sin adsorberse sobre el mismo. Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona seroalbúmina humana de alta pureza, que se prepara mediante un proceso de producción que incluye la etapa del método anterior y cuyo contenido de multímero es reducido. La presente invención se describirá a continuación con más detalle. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es un diagrama que muestra los resultados obtenidos sometiendo a HPLC por filtración en gel a una muestra obtenida después de dializar una disolución de HSA que contiene multímeros de la misma frente a un tampón fosfato 50 mM (pH 6,5) que contiene NaCl 75 mM (muestra antes del tratamiento) y a una fracción obtenida tratando la muestra dializada con una columna de cromatografía de intercambio aniónico fuerte equilibrada con la misma disolución tampón y recogiendo una fracción que pase por la misma (muestra después del tratamiento). MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN El método de la presente invención se caracteriza por tratar una disolución de seroalbúmina humana que contiene un multímero de la misma con una disolución tampón que tiene una concentración salina apropiada, poner en contacto posteriormente la disolución de seroalbúmina humana con un intercambiador aniónico equilibrado con la misma disolución tampón para adsorber por tanto el multímero sobre el intercambiador aniónico, eliminando así el... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar un monómero de seroalbúmina humana recombinante de una disolución que incluye un multímero de seroalbúmina humana recombinante, que comprende: (a) tratar la disolución a pH 9,0 durante más 5 horas para convertir el multímero de seroalbúmina humana recombinante en monómeros; y (b) cargar la disolución tratada por tanto en un intercambiador aniónico equilibrado con un tampón que contiene una sal a una concentración en el intervalo de 10 a 100 mM y que tiene un valor de pH en el intervalo de 5,5 a 7,5, y recuperar una fracción pasada a través del intercambiador aniónico sin adsorberse sobre el mismo. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón contiene la sal a una concentración en el intervalo de 25 a 100 mM y tiene un valor de pH en el intervalo de 5,5 a 7,5. 3. El método de la reivindicación 2, en el que el tampón contiene la sal a una concentración en el intervalo de 50 a 75 mM y tiene un valor de pH en el intervalo de 6 a 7. 4. El método según se expone en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el intercambiador aniónico es un intercambiador aniónico fuerte. 5. El método de la reivindicación 1, en el que la seroalbúmina humana recombinante se produce por células de levadura. 7 E01978882 01-12-2011   8 E01978882 01-12-2011