POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD CELOBIOHIDROLASA Y POLINUCLEÓTIDOS QUE LOS CODIFICAN.
Polipéptido aislado que tiene actividad de celobiohidrolasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso de la forma más preferible al menos 97% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2; (b) un polipéptido que se codifica por un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de astringencia altas con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico comprendiendo la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/000659.
Solicitante: NOVOZYMES, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95616 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: HARRIS, PAUL, BROWN,KIMBERLY, LOPEZ DE LEON,ALFREDO, MERINO,Sandra.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 6 de Enero de 2006.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/42 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
Clasificación PCT:
- C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.
PDF original: ES-2358243_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos con actividad celobiohidrolasa y polinucleótidos que los codifican.
Declaración de derechos de invenciones realizadas con la subvención del Gobierno Federal en materia de Investigación y Desarrollo.
Esta invención fue realizada con el soporte del Gobierno bajo el subcontrato NREL nº. ZCO-30017-02, contrato principal DE-AC36-98GO10337, otorgado por el Departamento de Energía. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes comprendiendo los polinucleótidos al igual que a métodos para producir y usar los polipéptidos.
La celulosa es un polímero de la simple glucosa del azúcar unida de manera covalente por enlaces beta-1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos enlazados en beta. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares al azar, abriéndose para el ataque por celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan consecutivamente moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiohidrolasa I es una actividad de 1,4-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetriosa, o cualquier glucosa enlazada en beta-1,4 conteniendo polímero, liberando celobiosa de las extremidades reductoras de la cadena. La celobiohidrolasa II es una actividad 1,4-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetriosa, o cualquier polímero conteniendo glucosa enlazada en beta 1,4, liberando celobiosa de las extremidades no reductoras de la cadena. La celobiosa es un dímero enlazado en beta-1,4 hidrosoluble de glucosa. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa. La celobiosa es un dímero enlazado en beta-1,4 hidrosoluble de glucosa. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.
La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad preparada de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar la combustión o vertido de residuo de los materiales, y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, brotes herbáceos, y residuos sólidos municipales han sido considerados como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa, y lignina. Una vez la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol.
WO 04/56981 divulga una celobiohidrolasa II de Chaetomium thermophilum.
Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de celobiohidrolasa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2;
(b) un polipéptido que se codifica por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo al menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico comprendiendo la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); y
(c) una variante comprendiendo una substitución conservadora, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos del polipéptido maduro de SEC ID nº: 2.
La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que codifican polinucleótidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, seleccionados del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2;
(b) un polinucleótido que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1 y
(c) un polinucleótido que se hibrida bajo al menos condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico comprendiendo la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 1, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii).
En un aspecto preferido, el polipéptido maduro es los aminoácidos 18 a 481 de SEC ID nº: 2. En otro aspecto preferido, la secuencia codificante del polipéptido maduro es los nucleótidos 52 a 1443 de SEC ID nº: 1.
La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, y células huéspedes recombinantes comprendiendo los polinucleótidos.
La presente invención también se refiere a métodos para producir tal polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante comprendiendo un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
La presente invención también se refiere a métodos de uso de los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa en detergentes y en la conversión de celulosa a glucosa.
La presente invención además se refiere a constructos de ácidos nucleicos comprendiendo un gen que codifica una proteína, donde el gen está enlazado operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que comprende o que consiste en los aminoácidos 1 a 17 de SEC ID nº: 2, donde el gen es extranjero a la secuencia de nucleótidos.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos deducida de una celobiohidrolasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 (Cel6A) (SEC ID Nos: 1 y 2, respectivamente).
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pAILo1.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pBANe10.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pAILo2.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo21.
La Figura 6 muestra la hidrólisis de PASC a glucosa por celobiohidrolasa Cel6A de Thielavia terrestris o Humicola insolens. β-glucosidasa de Aspergillus oryzae fue incluida en el ensayo para convertir celobiosa a glucosa.
La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pCW076.
La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pCW085.
Definiciones
Actividad de celobiohidrolasa: el término "actividad de celobiohidrolasa" se define aquí como una actividad de 1,4-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3,2,1,91) que cataliza la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetriosa, o cualquier glucosa enlazada en beta-1,4 conteniendo polímero, liberando celobiosa de las extremidades de la cadena. Para objetivos de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa se determina por la liberación de azúcar de reducción hidrosoluble de la celulosa como se mide por el método PHBAH de Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279. Una distinción entre el modo de ataque de la exoglucanasa a una celobiohidrolasa y el modo de ataque de la endoglucanasa se hace por una medición similar de la liberación de azúcar de reducción de celulosa sustituida tal como carboximetilcelulosa o hidroxietil celulosa (Ghose, 1987 Pure & Appl. Chem. 59: 257-268). Una celobiohidrolasa real tendrá una proporción muy alta de actividad en celulosa no sustituida contra celulosa sustituida (Bailey et al., 1993, Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 65-76).
Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polipéptido aislado que tiene actividad de celobiohidrolasa, seleccionado del grupo que consiste en:
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o que consiste en el polipéptido maduro de SEC ID nº: 2.
4. Polipéptido según la reivindicación 1, que se codifica por el polinucleótido contenido en plásmido pTter6A que está contenido en E. coli NRRL B-30802.
5. Polipéptido de cualquiera de reivindicaciones 1-4, donde el polipéptido maduro es los aminoácidos 18 a 481 de SEC ID nº: 2. y la secuencia codificante del polipéptido maduro es los nucleótidos 52 a 1443 de SEC ID nº: 1.
6. Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Constructo de ácidos nucléicos o un vector de expresión comprendiendo el polinucleótido según la reivindicación 6 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.
8. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 7.
9. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprendiendo: (a) cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje sea capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
10. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de reivindicaciones 1-5, comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped comprendiendo un constructo de ácido nucleico comprendiendo un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
11. Método para la producción del polipéptido según cualquiera de reivindicaciones 1-5, comprendiendo: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula de planta comprendiendo un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
12. Planta transgénica, parte de planta o célula de planta, que ha sido transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
13. Composición detergente comprendiendo un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa según cualquiera de reivindicaciones 1-5 y un tensioactivo.
14. Método para degradar o convertir la biomasa conteniendo celulosa y hemicelulosa, comprendiendo el tratamiento de la biomasa con una cantidad eficaz de un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
15. Método según la reivindicación 14, comprendiendo además el tratamiento de la biomasa con una cantidad eficaz de endo-1,4-beta-glucanasa y beta-D-glucosidasa.
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