POLINUCLEÓTIDOS DE PLANTAS QUE CODIFICAN PRENIL PROTEASAS.

Un ácido nucleico aislado que codifica prenil proteasa, donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo consistente de:

a) un polinucleótido de SEQ ID NO:7 b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 8; c) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad en secuencia con la secuencia nucleótidos de SEQ ID NO: 7. d) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:8 y e) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta d)

Campo de la Invención

La presente invención proporciona polinucleótidos novedosos que codifican polipéptidos de prenil proteasas, y homólogos de los mismos. También se proporcionan vectores y casetes de expresión, células vegetales que contienen estos, plantas que comprenden dichas células vegetales y métodos recombinantes para producir dichas plantas. La divulgación se relaciona adicionalmente con métodos para aplicar estos novedosos polipéptidos de plantas a la identificación, prevención y/o conformamiento de resistencia a diversas enfermedades y/o trastornos de plantas, particularmente resistencia a la sequía, y/o para manipular la cantidad de compuestos almacenados en semillas, particularmente aceites, azúcares y proteínas.

Antecedentes de la Invención

La sequía es uno de los factores más limitantes en el crecimiento y productividad de las plantas. Los cultivos y los rendimientos pierden debido a la sequedad en cultivos tales como soja, maíz, arroz y algodón que representa un factor económico significativo. Adicionalmente, la sequedad también es responsable de escasez de alimentos en muchos países en el mundo. Desarrollar cultivos tolerantes a la sequedad es una estrategia que tiene potencial para aliviar algunas de estas situaciones adversas.

Las estrategias de cruce tradicional de plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban tolerancia a la sequedad son relativamente lentas y requieren líneas tolerantes específicas para entrecruzar con las líneas comerciales deseadas. Los recursos de germoplasma limitados para tolerancia a la sequedad en compatibilidad en cruces entre especies de plantas relacionadas de forma distante representan por lo tanto problemas significativos encontrados en los cruces convencionales. En contraste, la transformación genética de las plantas y la disponibilidad de genes útiles sometidos a patrones de expresión específicos permiten generar plantas tolerantes a la sequedad utilizando métodos transgénicos.

Las plantas están expuestas durante su ciclo de vida total a condiciones de contenido de agua ambiental reducido. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad o duración de las condiciones de sequía son extensas, los efectos sobre el desarrollo de las plantas, crecimiento y rendimiento de la mayor parte de los cultivos son profundos.

La fisiología de una planta tensionada por sequía se altera dramáticamente en comparación con una planta que crece bajo condiciones normales. La mayor parte de los cambios y sus causas aun no están caracterizados. El ácido abscísico (ABA) juega un papel central en la mediación de los procesos entre la percepción de la desecación y los cambios celulares. El ABA se incrementa fácilmente al aparecer la desecación de las células. Este incremento produce el cierre de los estomatas, disminuyendo por lo tanto la pérdida de agua a través de la transpiración.

Los lípidos almacenados en las semillas se sintetizan a partir de precursores derivados de carbohidratos.

Las plantas tienen efecto una ruta glicolítica completa en el citosol (Plaxton 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 185-214) y se ha demostrado que existe también una ruta completa en los plástidos de semillas de colza (Kang & Rawsthorne 1994, Plant J. 6 : 795-805). La sacarosa es la fuente primaria de carbono y energía, transportada desde las hojas hacia las semillas en desarrollo. Durante la fase de almacenamiento de las semillas la sacarosa se convierte en citosol para proveer los precursores metabólicos glucosa-6-fosfato y piruvato. Estos se transportan hacia los plástidos y se convierten en acetil-CoA que sirve como precursor primario para la síntesis de ácidos grasos. Aunque varios ácidos nucleicos que están involucrados en las etapas enzimáticas del metabolismo de los lípidos, ácidos grasos y almidón han sido clonados e identificados, hay probablemente una multitud de tales ácidos nucleicos vegetales que no han sido identificados aun. El análisis fenotípico de diversas plantas oleaginosas y otras plantas mutadas ha revelado otras proteínas putativas involucradas en el metabolismo de los lípidos vegetales, pero la técnica anterior aun tiene que describir la localización genómica de estas proteínas o la secuencia de los ácidos nucleicos que las codifican.

La regulación de la fosforilación de las proteínas por quinasas y fosfatasas se acepta como un mecanismo universal de control celular (Cohen 1992, Trends Biochem. Sci. 17: 408-413), y de Ca2+ y las señales de calmodulina son transducidas frecuentemente a través de Ca2+ y quinasas y fosfatasas dependientes de calmodulina (Roberts & Harmon 1992, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 375-414.). El ácido okadáico, un inhibidor de proteína fosfatasa, ha mostrado afectar ambas rutas del ácido giberélico (GA)y ácido abscísico (ABA) (Kuo et al. 1996, Plant Cell. 8: 259-269). Aunque las bases moleculares están involucradas en todos los procesos regulatorios en el desarrollo de las semillas (por ejemplo Ritchie & Gilroy 1998, Plant Physiol. 116: 765-776; Arenas-Huertero et al. 2000, Genes Dev. 14: 2085-2096). De la misma forma, las hormonas etilénicas de plantas (por ejemplo Zhou et al.

1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10294-10299; Beaudoin et al. 2000, Plant Cell 2000: 1103-1115) y la auxina (por ejemplo Colon-Carmona et al. 2000, Plant Physiol. 124: 1728-1738) están involucradas en el control del desarrollo de las plantas también.

La farnesilación de las proteínas, la adición de un terminal C, una cadena de 15 carbonos a proteínas y subsecuente procesamiento, se han identificado como cruciales para el papel de mediación del ABA en la cadena de transducción de la señas de desecación (1). En resumen, se requiere la farnesilación de las proteínas para el cierre de los estomas inducido por el ABA, así como para el control de la pérdida de agua.

La farnesilación de las proteínas es una reacción enzimática en tres etapas como se muestra en la Figura 1. El fenotipo tolerante a la sequedad del mutante eral de Arabidopsis se debe a una mutación nula en la subunidad beta de la enzima farnesil transferasa (FTasa), la primer enzima en la ruta de la farnesilación de las proteínas.

Actualmente, las secuencias correspondientes a los clones de otras enzimas involucradas en la farnesilación de la proteína, ha saber, prenil proteasa (PrPasa) y metilasa no han sido descritas en la literatura sobre vegetales. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica para identificar genes vegetales que codifiquen estas enzimas de farnesilación de proteínas como otra oportunidad para generar plantas tolerantes a condiciones de secantes (por ejemplo, sequía).

Breve Resumen de la Invención

La presente invención proporciona novedosos polinucleótidos que codifican polipéptidos de prenil peptidasa.

La presente divulgación describe adicionalmente un método general para manipular plantas tolerantes a la sequedad. Dicho método es en general aplicable a todas las plantas.

Se divulga adicionalmente el promotor del gen Arabidopsis FTasa. Este promotor se expresa lo más fuertemente en células guardiánes, esto es, un promotor especifico de una célula guardián.

Otro aspecto de la divulgación proporciona vectores de expresión en levaduras utilizados para producir grandes cantidades de la Arabidopsis PrPasa en levadura.

Se describen adicionalmente en esta divulgación vectores de transformación utilizados para transformar plantas de Arabidopsis, colza, soja y maíz.

Adicionalmente, la divulgación proporciona métodos para aplicar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención para crear plantas transgénicas con comportamientos deseables, los cuales incluyen, pero no se limitan, a una defensa potenciada de las plantas, tolerancia a la sequedad, tolerancia a la sal, tolerancia al ultravioleta (UV), desarrollo potenciado de flores, síntesis de terpenos y formación incrementada de compuestos de almacenamiento en semillas, tales como aceites, azúcares y proteínas.

Se divulga adicionalmente el promotor del gen Arabidopsis USP. Este promotor se expresa de la forma más fuerte durante las etapas de desarrollo de las... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que codifica prenil proteasa, donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo consistente de:

a) un polinucleótido de SEQ ID NO:7 b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 8; c) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad en secuencia con la secuencia nucleótidos de

SEQ ID NO: 7. d) Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:8 y e) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta d).

2. El ácido nucleico que codifica la prenil proteasa de la reivindicación uno, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona en la farnesilación de la proteína.

3. Un ácido nucleico aislado que hibridiza bajo condiciones restrictivas a un polinucleótido complementario a la secuencia de SEQ ID NO: 7, donde el ácido nucleico codifica una prenil proteasa.

4. Un vector o casete de expresión que comprende un ácido nucleico de 1 a cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

5. Una célula de planta transgénica que contiene el vector o el casete de expresión de la Reivindicación 4.

6. Una planta transgénica que comprende una célula de planta de la Reivindicacion 5.

7. La planta de la Reivindicación 6, donde la planta es una monocotiledonea o dicotiledónea.

8. La planta de la Reivindicación 6 o 7, donde la plata es seleccionada del grupo consistente de maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, manihot, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, Palma de aceite, coco, pastos perennes y cultivos de forrage.

9. Una semilla de planta producida por la planta de la Reivindicación 6, donde la semilla es una variedad verdadera para una tolerancia incrementada a tensión ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla, y la semilla contiene un ácido nucleico introducido como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

10. Un método para producir una planta transgénica que contiene un ácido nucleico que codifica prenil proteasa donde la planta tiene una tolerancia incrementada a una tensión ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende transformar una célula de planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico y generar desde la célula de la planta la planta transgénica, donde el ácido nucleico es seleccionado del grupo consistente de:

a) Un polinucleótido de SEQ ID NO: 3; b) Un polinucleótido de SEQ ID NO: 5; c) Un polinucleótido de SEQ ID NO: 7; d) Un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 4; e) Un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 6; f) Un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 8; g) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos

de SEQ ID NO: 3,5º 7; h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 4, 6 o 8 y i) un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta h).

11. El método de la Reivindicación 10, donde el estrés ambiental es seleccionó del grupo consistente de alta salinidad, sequía y temperatura.

12. El método de la Reivindicación 10 o 11, donde la planta es una monocotiledonea o dicotiledónea.

13. El método de la Reivindicación 10, 11, o 12, donde la planta es seleccionada del grupo consistente de: trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, manihot, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, Palma de aceite, coco, pastos perennes y un cultivo de forrage.

14. El método de cualquiera de las 1. a 13, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona en la farnesilación.

15. El método de cualquiera de las 1. a 14, donde dicho ácido nucleico está enlazado operativamente a un promotor que dirige la expresión del ácido nucleico.

16. El método de la Reivindicación 15, donde el promotor es específico para el tejido o está regulado en función del desarrollo.

17. Uso del ácido nucleico de una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, el vector o el casete de expresión de la Reivindicación 4, la célula de planta de la Reivindicación 5, la planta de cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8 o la semilla de planta de la Reivindicación 9 para la producción de una planta que tiene una tolerancia incrementada a un estrés ambiental.