Polinucleótido que comprende secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante RNAi.

La presente invención se refiere al silenciamiento especifico de las · (alfa), · (beta), · (gamma) y o·(omega)-gliadinas de trigo duro y harinero mediante RNA de interferencia (ARNi) por medio del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un hpRNA (hairpin RNA). Además, la presente invención también se refiere a un vector, célula, planta o semilla que comprenden el polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de ·-gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína

Polinucleótido que comprende secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante RNAi.

La presente invención se refiere al silenciamiento específico de las α (alfa), β (beta), γ (gamma) y ω (omega)-gliadinas de trigo duro y harinero mediante RNA de interferencia (ARNi) por medio del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un hpRNA (hairpin RNA). Además, la presente invención también se refiere a un vector, célula, planta o semilla que comprenden el polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de γ-gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína.

Estado de la técnica anterior

La interferencia de RNA (RNAi) es un sistema de degradación del RNA mensajero mediado por RNA de doble cadena que permite el silenciamiento específico de determinados genes. Su descubriendo ha permitido el diseño de vectores compuestos de un promotor y señales de terminación, y entre ellos la secuencia del gen que se desea silenciar, en orientación sentido y antisentido, separados por una secuencia espadadora de longitud variable.

Los siRNAs (de las siglas en inglés small interfering RNA, o short interfering RNA) son moléculas de RNA de doble hebra (dsRNA de las siglas en inglés double-stranded RNA) de 21-25 nucleótidos (nts), que se originan a partir de un dsRNA precursor más largo. Los dsRNAs precursores pueden ser de origen endógeno, en cuyo caso se habla de miRNA (codificados en el genoma del organismo) o de origen exógeno (como virus o transgenes). Tanto siRNA como miRNA son dos tipos de RNAi (RNA de interferencia). El RNAi suprime la expresión post-transcripcional de un determinado mRNA (de las siglas en inglés messenger RNA) reconocidos por la secuencia de RNAi.

Cuando una célula recibe un dsRNA precursor (los RNA de hebra simple no producen este efecto), que puede generarse a partir de un transgén exógeno, un agente viral o un elemento genético propio, se fragmenta en siRNAs por la acción de una enzima denominada Dicer, una enzima citoplásmica de la familia RNAsa III. Dicer corta el dsRNA en fragmentos de doble cadena de alrededor de 21-25 nucleótidos (siRNA), con el extremo 5' fosforilado y dos nucleótidos sobresaliendo, sin aparear, en el extremo 3'. De las dos cadenas del siRNA solo una, denominada hebra guía, se incorpora en el complejo enzimático RISC (RNA-induced silencing complex) mientras que la otra hebra se degrada. Las características termodinámicas del extremo 5' del siRNA determinan cual de las dos hebras se incorpora al complejo RISC. Normalmente se incorpora como hebra guía aquella con menor estabilidad en el extremo 5', bien porque contenga un mayor contenido en bases AU o bien por apareamientos imperfectos. Para que se produzca el silenciamiento post-transcripcional la hebra guía debe ser complementaria al mRNA que se pretende silenciar. A continuación, el complejo RISC se une al mRNA complementario de la hebra guía del siRNA presente en el complejo y se produce el corte del mRNA. Posteriormente se produce la degradación de los fragmentos obtenidos. De esta manera, los siRNAs provocan el silenciamiento post-transcripcional de las secuencias nucleotídicas diana, de forma que no se obtiene la proteína resultante de la expresión de estas secuencias.

En trigo, las proteínas del grano, aunque minoritarias (7-18%) respecto a los hidratos de carbono (60-75%), son fundamentales para las propiedades funcionales de la harina. Las principales proteínas del grano son las gluteninas y las gliadinas, que constituyen el gluten. Las gliadinas son responsables del desarrollo de la enfermedad celíaca ya que epítopos (determinantes antigénicos) reconocidos por las células T intestinales han sido identificados en regiones de α y γ-gliadinas (Arentz-Hansen, et al., 2002. Gastroenterology 123:803-809). Las personas que sufren la enfermedad celíaca tienen intolerancia al gluten. La intolerancia al gluten se caracteriza por una inflamación crónica de la parte proximal del intestino delgado, causada por la exposición de gliadina. Mediante un trigo que tenga muy disminuido el contenido de gliadinas, se podría elaborar un alimento para celiacos.

Se conocen cuatro tipos de gliadina; α (alfa), β (beta), γ (gamma) y ω (omega). La supresión de gliadinas de granos de trigo empleando la tecnología de RNAise ha venido utilizando en los últimos años. Hasta la fecha, solamente se ha conseguido suprimir una parte de las gliadinas. Por ejemplo, mediante el empleo de construcciones genéticas que dan lugar a RNAi tipo hairpin (horquilla), cuya estructura es: Promotor-Secuencia sentido-Espaciador-Secuencia antisentido-Terminador, se han conseguido eliminar gliadinas del tipo α (Folck et al., 2005. XII International Conference on Plant Embryology. Oral presentation) o del tipo γ (Gil-Humanes et al. 2008. Journal of Cereal Science 48(3):565-568), casi por completo, pero no se han conseguido eliminar todos los tipos de gliadinas de manera eficaz.

La obtención de plantas que tengan muy reducida la cantidad de gliadinas en sus semillas presenta dificultades técnicas como son, en primer lugar, el número elevado de genes que codifican para gliadinas y, en segundo lugar, que las plantas de trigo son hexaploides. Conseguir una transformación estable en las plantas de trigo presenta más dificultades que la transformación de cualquier otra planta con menor número de copias del genoma.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende dos pares de secuencias donde cada subsecuencia se combina en un orden determinado para dar lugar a una secuencia cuya transcripción a RNA sea capaz de originar un hpRNA (haipin RNA), es decir, un RNA en forma de horquilla, un RNA de doble hebra que será procesado por endoribonucleasas descritas en el estado de la técnica, por mediación de las cuales se generan los siRNA que producen el silenciamiento post-transcripcional de todos los mRNA (RNA mensajeros) que codifican para todos los tipos de gliadinas de trigo. Para ello, las cuatro subsecuencias son; la secuencia en orientación sentido de las ω-gliadinas, la secuencia en orientación sentido de las α, β y γ-gliadinas y las dos secuencias anteriores en orientación antisentido.

Mediante este polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de γ-gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína, se consigue el silenciamiento post-transcripcional de todos los genes de especies de trigo blando y de especies de trigo duro de manera eficaz y sinérgica, ya que se consiguen silenciar más cantidad de genes de gliadinas cuando se comparan con los resultados de silenciamiento de α y γ-gliadinas mediante hpRNA que se describen en el estado de la técnica. Ello se debe fundamentalmente al diseño específico de las subsecuencias en orientación sentido y antisentido cuyos siRNA generados hibridan con todos los mRNA de las α, β, γ y ω-gliadinas de trigo en combinación con promotores de las gliadinas con niveles de expresión más elevados, inducibles en tejidos específicos de la semilla de trigo. Este diseño se ha llevado a cabo mediante la identificación de grupos de gliadinas que contienen epítopos reconocidos por las células T humanas, de modo que el silenciamiento de las proteínas que los contienen da lugar a semillas de trigo con las que se pueden obtener productos aptos para personas que presentan alergia al gluten.

En la presente invención se emplean los términos DNA o RNA para referirse al ácido desoxirribonucleico o al ácido desoxirribonucleico respectivamente.

En este sentido, un aspecto de la presente invención es un polinucleótido con al menos un 90% de identidad con respecto a una secuencia que comprende dos pares de secuencias (a1-a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espadadora donde:

1. Polinucleótido con al menos un 90% de identidad con respecto a una secuencia que comprende dos pares de secuencias (a1-a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde: