Un procedimiento para la producción de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso central humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC),

comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una población que contiene células neurales o derivadas de células neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para células que se unen a un anticuerpo distinto de un anticuerpo monoclonal AC133, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 para producir una población enriquecida en NS-IC

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere de manera general a poblaciones de células madre neurales enriquecidas y células progenitoras, y a procedimientos para la identificación, aislamiento y enriquecimiento de células madre neurales y células progenitoras, particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central y, más particularmente, a poblaciones enriquecidas de células que inician neurosferas (NS-IC).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las poblaciones de células madre sólo constituyen un pequeño porcentaje del número total de células, pero son de enorme interés debido a su capacidad para repoblar el cuerpo. La longevidad de las células madre y la diseminación de la progenie de las células madre son características deseables. Hay un interés comercial importante en estos procedimientos debido a que las células madre tienen una serie de usos clínicos. También hay interés médico en el uso de células madre como vehículo para terapia génica.

Las proteínas y otros marcadores de la superficie celular encontrados en poblaciones de células madre y células progenitoras son útiles en la preparación de reactivos para la separación y el aislamiento de estas poblaciones. Los marcadores de la superficie celular también son útiles en la caracterización posterior de estas células importantes.

Yin y col., patente de EE.UU. 5.843.633 describe un anticuerpo monoclonal denominado AC133, que se une a una glicoproteína marcadora superficial sobre células madre y células progenitoras hematopoyéticas. El antígeno AC133 es un antígeno de la superficie celular 5-transmembrana con un peso molecular de 117 kDa. La expresión de este antígeno es muy específica de tejido, y se ha detectado en un subgrupo de células progenitoras hematopoyéticas derivadas de médula ósea humana, médula ósea e hígado fetales, sangre de cordón umbilical, y sangre periférica adulta. El subgrupo de células reconocido por el anticuerpo AC133 es CD34bright, y contiene sustancialmente toda la actividad CFU-GM presente en la población CD34+, haciendo a AC133 útil como reactiva para el aislamiento y caracterización de células madre y células progenitoras hematopoyéticas humanas.

No obstante, no se han identificado los marcadores superficiales específicos para células madre y células progenitoras no hematopoyéticas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central. Además, el anticuerpo AC133 no se ha usado en procedimientos para la identificación, aislamiento, o enriquecimiento de células madre o células progenitoras no hematopoyéticas, particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC). Aún existe la necesidad de herramientas, tales como anticuerpos monoclonales que sean útiles en el aislamiento y caracterización de células madre y células progenitoras no hematopoyéticas humanas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención proporciona procedimientos para la identificación, aislamiento, y enriquecimiento de células madre neurales del sistema nervioso central (SNC) que pueden iniciar neurosferas (NS-IC) y células progenitoras. Una "célula que inicia neurosferas (NS-IC)" es una célula que puede iniciar un cultivo de neurosferas a largo plazo. Una "neurosfera", a su vez, es un agregado o grupo de células que incluye células madre neurales y células progenitoras primitivas. La identificación, cultivo, crecimiento, y uso de neurosferas se describe en Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y Weiss y col., patente de EE.UU. 5.851.832. Aunque el término "NS-IC" está definido por la aptitud o capacidad de esa célula de formar una neurosfera, estas células pueden crecer adecuadamente en cultivos adherentes (véase, por ejemplo, Johe, patente de EE.UU. 5.753.506), y se debe apreciar que los procedimientos y poblaciones descritos en el presente documento no están limitados a cultivos en suspensión de NS-IC. Una NS-IC es nestina+ y tiene la capacidad de diferenciarse, en condiciones de diferenciación apropiadas, en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos.

Según una forma de realización de esta invención, las poblaciones enriquecidas de células madre neurales del SNC que pueden iniciar neurosferas (NS-IC), y células progenitoras, y el procedimiento de identificación, aislamiento, o enriquecimiento de esas células, se consigue poniendo en contacto una población de células que no procede de embriones humanos que contiene al menos una célula madre o NS-IC, o una célula progenitora, con un reactivo que se une al antígeno glicoproteína marcador superficial ("antígeno AC133") reconocido por el anticuerpo AC133, en el que el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 (distinto del anticuerpo monoclonal AC133) incluyendo un fragmento del mismo. El uso de técnicas tradicionales para la clasificación de células, tales como la inmunoselección (por ejemplo, FACS), permite entonces la identificación, el aislamiento y/o el enriquecimiento de células en las que se ha detectado el contacto entre el reactivo y el antígeno AC133.

En una forma de realización preferida, las células de esta invención, preferentemente las células madre neurales del SNC, están caracterizadas adicionalmente como células que carecen de marcadores superficiales para CD45 y CD34.

En una forma de realización adicional, esta invención usa un anticuerpo novedoso, denominado en el presente documento 8G1, que se cree que reconoce CD24, lo cual permite la subselección entre poblaciones de células madre neurales del SNC (caracterizadas como 8G1-/lo) y poblaciones de células progenitoras del SNC (caracterizadas como 8G1+).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es un diagrama que ilustra la proliferación y diferenciación de una NS-IC.

La figura 2 es una serie de fotografías que muestran que el cultivo de neurosferas se puede iniciar a partir de células 5F3+ seleccionadas de una sola célula.

La figura 3 es una representación de puntos de los datos de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) que muestra el aislamiento de células madre neurales del SNC humano usando marcadores de la superficie celular usando el anticuerpo monoclonal 5E12. El eje x representa la tinción de células para anticuerpos con relación a CD34 y CD45. El eje y representa la tinción de células con el anticuerpo 5E12.

La figura 4 es una representación de puntos en dos paneles de los datos de clasificación por FACS que muestra el aislamiento de células madre neurales humanas mediante marcadores de la superficie celular. Se disociaron enzimáticamente células cerebrales fetales humanas como se describe. El panel A muestra que las células 5F3+ co-expresan el antígeno para el anticuerpo 5E12. El panel B muestra que las células 5F3+ normalmente no expresan el antígeno para el anticuerpo 8G1 (CD24).

La figura 5 es un diagrama que muestra la distribución de células 5F3+ en el cerebro fetal en función de la edad de gestación.

La figura 6 es una serie de fotografías que muestran los resultados del trasplante de células neurales humanas en ratón NOD SCID.

La figura 7 es una serie de fotografías que muestran que la progenie de células clasificadas 5F3+ migran a través de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfativo cuando son trasplantadas en un modelo de roedor.

La figura 8 es una serie de fotografías que muestran que la progenie de células clasificadas 5F3+ migra a través de la RMS hacia el bulbo olfativo cuando son trasplantadas en un modelo de roedor.

La figura 9 muestra las características de las células AC133+. La figura 9A es una separación citométrica de flujo de células cerebrales fetales frescas basada en la expresión de AC133. Las células cerebrales fetales humanas se disociaron enzimáticamente. Las células se tiñeron con mAbs contra CD34, CD45 y AC133, y se separaron en fracciones AC133 -y AC133+. Las células hematopoyéticas y endoteliales residuales se excluyeron mediante el control de CD45 -y CD34 -, respectivamente. Los subgrupos AC133 -(figura 9B) y AC133+ (figura 9C) clasificados se cultivaron en medio exento de suero y la proliferación de estas células clasificadas se controló durante 15...

1. Un procedimiento para la producción de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso central humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC), comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una población que contiene células neurales o derivadas de células neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para células que se unen a un anticuerpo distinto de un anticuerpo monoclonal AC133, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 para producir una población enriquecida en NS-IC.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD34.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45 y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD34.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a por lo menos un epítopo de la Prominina.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es monoclonal o policlonal.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena sencilla.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está conjugado a un fluorocromo.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está conjugado a una partícula magnética.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la selección se lleva a cabo por citometría de flujo.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la selección se lleva a cabo por clasificación

celular activada por fluorescencia o separación magnética de alto gradiente.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la población que contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene a partir de un cultivo de neurosferas o de un cultivo de monocapa adherente.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la población que contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene a partir de tejido neural o cualquier tejido que da lugar a tejido neural.

14. Un procedimiento para el aislamiento de una célula madre que inicia neurosferas (NS-IC), que comprende:

(a) la selección a partir de una población de células neurales o derivadas de células neurales de al menos una célula seleccionada que se une a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno AC133 distinto del anticuerpo monoclonal AC133;

(b) la introducción de dicha al menos una célula seleccionada en un medio de cultivo exento de suero que contiene uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo constituido por el factor inhibidor de la leucemia (LIF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y sus combinaciones; y

(c) la proliferación de dicha al menos una célula seleccionada en el medio de cultivo.

15. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 14, que además comprende las etapas de: enriquecer adicionalmente una población en CNS-SC eliminando de la población aquellas células que son capaces de unirse al anticuerpo monoclonal 8G1.