En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de la secuencia original,

así como los usos para utilizar estas construcciones en la evaluación de sistemas de extracción de ácidos nucleicos, en la clonación de fragmentos del gen pol y del gen que codifica para la proteasa del virus VIH-1 y en el análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales, así como los correspondientes métodos para realizar la evaluación de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos y para la construcción de los plásmidos

Plásmidos que incluyen la secuencia del VIH-1 y sus usos.

En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de la secuencia original, así como los usos para utilizar estas construcciones en la evaluación de sistemas de extracción de ácidos nucleicos, en la clonación de fragmentos del gen pol y del gen que codifica para la proteasa del virus VIH-1 y en el análisis de la resistencia fenotípica de VIH-1 de muestras clínicas a antirretrovirales, así como los correspondientes métodos para realizar la evaluación de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos y para la construcción de los plásmidos.

Estado de la técnica anterior

Las pruebas diagnósticas moleculares pueden seguir tres pasos consecutivos: extracción, amplificación/detección y análisis de datos. El primero de estos pasos, la extracción, condiciona el tiempo de respuesta de la prueba y, a su vez, éste está condicionado por el tipo y cantidad de la muestra, que debe ser siempre representativo del compartimento que se pretende analizar. El diseño de sistemas para la extracción de ácidos nucleicos, paso previo a cualquier detección molecular diagnóstica, se basa cada vez de forma más acentuada en el uso de nanopartículas magnéticas y lleva asociada una química diseñada para lograr la absorción inespecífica del ácido nucleico a la nanopartícula. El control de los métodos de producción y el rendimiento de los sistemas de extracción se ha basado en el posterior funcionamiento del sistema de detección que incluye una reacción de amplificación. Este proceso de expansión de la diana, imprescindible en la mayor parte de los test diagnósticos en uso, hace que el paso previo de extracción haya tenido sólo una importancia relativa, pero cada vez más, debido a las condiciones previamente apuntadas (duración del test e importancia del compartimento que se quiere analizar), este paso inicial cobra más transcendencia.

Se conocen dos tipos de soluciones alternativas para el control de la extracción y valoración de su calidad: 1) Colecciones o paneles de sueros estándar (Ronsin et al., 2006. J. Clin. Microbiol., 44:4, 1390-1399) y 2). Uso de muestras aleatorias obtenidas de pacientes.

Las evaluaciones encontradas hasta la fecha, no incluyen ni los plásmidos propuestos en esta invención, ni su combinación (Loens et al., 2007. J. Clin. Microbiol. 45:2, 421-425). En el mercado se encuentra disponible OptiQual® un set de controles de ARN de VIH-1 que provee una herramienta para testar los resultados obtenidos mediante diferentes metodologías, evaluando o comparando nuevos procedimientos basados en el uso de ácidos nucleicos para la determinación del virus VIH-1.

Los plásmidos objeto de la presente invención ofrecen un método alternativo para evaluar y comparar la calidad de la extracción de los sistemas de extracción de ácido nucleicos, cuya eficacia se muestra en el correspondiente ejemplo de la presente invención.

Además, aunque NL4.3 ha sido usado para la evaluación fenotípica de resistencias de VIH a los antirretrovirales, los sistemas comerciales y experimentales similares al que se presenta en esta invención, no son capaces de facilitar la discriminación en la aportación de diferentes regiones de los fragmentos clonados en la resistencia de diversos fenotipos de VIH a antirretrovirales. Por tanto, se provee de un modelo capaz de caracterizar los genes y las subregiones genómicas de VIH-1 implicadas en la resistencia a antirretrovirales. Con ello se permite la clonación y el estudio de fragmentos progresivamente más largos del mismo gen, con lo que se puede determinar la aportación de las porciones diferentes del espacio de secuencia correspondiente al gen pol, usando cada una de las construcciones tras pseudotiparlas con la secuencia correspondiente del paciente en la valoración de la resistencia a los antirretrovirales.

Las regiones de la proteasa y de la retrotranscriptasa son reguladoras de la actividad del virus VIH-1 en etapas clave del proceso de infección y, por tanto, fundamentales para el éxito de la integración del ADN viral en el ADN del huésped. La proteasa actúa cortando unidades de las proteínas Gag, Pol y de la Gag-Pol. La retrotranscriptasa tiene la función de sintetizar el ADN de doble cadena del provirus usando como patrón la cadena singular del ARN viral; es una ADN-polimerasa actúa como dependiente del ARN. Una parte de los fármacos empleados para evitar la progresión del ciclo vital del virus VIH son inhibidores de la función de estos genes, así pues, los pseudotipos virales construidos usando secuencias de los genes de los virus aislados en los pacientes en las construcciones de la presente invención, permiten valorar el comportamiento in vivo de estos fármacos en la infección por VIH en experimentos de inhibición de la infección usando concentraciones crecientes de antiretrovirales.

Explicación de la invención

En la presente invención se proveen cuatro plásmidos en los que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón sin cambio en la traducción de una secuencia original, así como los usos para dos aplicaciones alternativas (1) evaluar los sistemas de extracción de ácidos nucleicos; cantidad, pureza e integridad de los fragmentos de ácidos nucleicos ADN y ARN eluídos y (2) valoración de la resistencia fenotípica de VIH-1 a antirretrovirales, es decir, el análisis fenotípico de resistencias VIH que permite valorar el "fitness" genético del virus o el papel de mutaciones compensatorias al usar secuencias más largas de la que habitualmente se usa en este tipo de análisis con NL4.3, que es la integración en el vector del fragmento ApaI-PinAI. Asimismo, la presente invención provee el método de construcción de estos plásmidos, así como el método para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ADN y ARN eluídos.

Las cuatro construcciones están basadas en un virus VIH tipo NL4.3 (Adachi et al., 1986. J. Virol. 59:284-291.) NIH AIDS Reagent Reference Program (Cat. Num.: 144.), en las que se han creado mutaciones dirigidas al tercer nucleótido del codón, de forma que, siendo la expresión de aminoácidos idéntica a la de la secuencia original, se generen sitios únicos de restricción en posiciones sucesivas del gen pol del virus VIH-1. La ventaja de este sistema es que es posible obtener ácidos nucleicos con cuatro polimorfismos de un solo nucleótido (de las siglas en inglés SNP, Single nucleotide polimorphism) y además, al tener secuencias conocidas, podemos obtener la construcción como ADNs lineales (por corte en lugares únicos comunes como ApaI) o circulares. Alternativamente puede obtenerse por transfección con Calphos^TM (Invitrogen) en células empaquetadoras (por ejemplo, células 293T/17), viriones VIH infecciosos que puedan usarse como origen de ARNs o en el otro uso alternativo de la invención como herramienta para la infección experimental "in vivo" y la posible valoración de la capacidad inhibitoria de los antiretrovirales.

Para evaluar el rendimiento de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos, se lleva a cabo la extracción de los plásmidos integrados en una mezcla estándar cuya cantidad y composición inicial es conocida. Una aplicación colateral desarrollada, es la posibilidad de un rápido análisis clonal que detecte sesgos en el proceso de extracción que puede realizarse por pirosecuenciación, con pares de cebadores que hemos diseñado y reconocen de forma específica cada uno de los plásmidos de la presente invención permitiendo valorar la calidad de la extracción realizada. Los sistemas convencionales de análisis clonal mediante los cuales se determina la calidad del proceso de extracción, son procesos que no determinan sesgos, que recuperan de forma equilibrada todas las especies de ácidos nucleicos, y que se suelen hacer por transfección en bacterias y análisis individual de clones bacterianos que crecen de la placa de cultivo tras la transformación. Éste es un método largo y laborioso. En la presente invención esta determinación se puede hacer de forma rápida utilizando cebadores mediante los que, por pirosecuenciación, se detectan los diferentes polimorfismos y permiten comparar el porcentaje de especies de cada uno de los cuatro tipos de ácido nucleico incluidos en la presente invención tras el proceso de extracción en cuestión de horas.

La producción de reactivos... [Seguir leyendo]

1. Plásmido seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

2. Célula empaquetadora transfectada con cualquiera de los plásmidos según la reivindicación 1.

3. Virión que contiene el ARN codificado por cualquiera de los plásmidos según la reivindicación 1.

4. Célula reporter transfectada con cualquiera de los viriones según la reivindicación 3.

5. Uso del plásmido según la reivindicación 1, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ADN.

6. Uso del virión según la reivindicación 3, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la calidad de los sistemas de extracción de ARN.

7. Uso del plásmido según la reivindicación 1, o cualquiera de sus combinaciones, para clonar fragmentos del gen pol y de la proteasa del ADN del virus VIH-1.

8. Uso del plásmido según la reivindicación 1, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la resistencia de fenotipos del virus VIH-1 a antirretrovirales.

9. Uso del virión según la reivindicación 3, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la resistencia de fenotipos del virus VIH-1 a antirretrovirales.

10. Uso de la célula según la reivindicación 4, o cualquiera de sus combinaciones, para evaluar la resistencia de fenotipos del virus VIH-1 a antirretrovirales.

11. Método de construcción de un plásmido según la reivindicación 1 que comprende: