PLÁSMIDOS QUE CODIFICAN PARA VARIANTES DE SECUENCIA DE LA PROTEÍNA P185NEU Y SUS USOS TERAPÉUTICOS DE LOS MISMOS.

Plásmidos que codifican para variantes de secuencia de la proteína p185 neu y usos terapéuticos de los mismos La presente invención se refiere a vectores de plásmidos que contienen secuencias de ADN que codifican para formas truncadas y quiméricas de la proteína p185 neu , y al uso de los mismos en la vacunación con ADN contra tumores positivos para Her-2/neu (ErbB-2) que expresan la proteína p185 neu . Los plásmidos según la invención pueden provocar una respuesta inmunitaria protectora que se basa en la inducción de anticuerpos y/o linfocitos T contra tumores que expresan la proteína p185 neu . La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen tales plásmidos y al uso de los mismos en el tratamiento preventivo o terapéutico de tumores positivos para p185 neu . Antecedentes de la invención Las células neoplásicas a menudo difieren de las células normales porque expresan varias proteínas de manera anómala. Debido a esta expresión anómala, algunas proteínas pueden actuar como antígenos asociados a tumores (TAA). Esto es por lo que el sistema inmunitario del huésped puede reconocer estas anomalías y provocar una respuesta inmunitaria que podría proteger al huésped de la aparición y el desarrollo del tumor. Para ser una diana de la inmunoterapia antitumoral, un TAA debe: tener un papel patogénico en un determinado estadio de crecimiento neoplásico; poder detectarse por el sistema inmunitario incluso cuando el tumor da lugar a variantes clonales que ya no expresan glicoproteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA); reconocerse tanto por anticuerpos como por linfocitos T. Se han descubierto varios TAA en carcinomas humanos en los últimos años. Entre ellos, p185 neu , el producto proteico del oncogén Her-2/neu (ErbB2), es una diana particularmente adecuada para la inmunoterapia (Lollini y Forni, 2003, Trends Immunol. 24: 62). p185 neu es un receptor de membrana de la familia de tirosina cinasa de receptor de clase I, que también abarca el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R o ErbB-1) y otros receptores relacionados (ErbB-3, ErbB-4) que desempeñan un papel clave en la diferenciación y proliferación celular (Hynes y Stem, 1994, BBA 1198: 165). La proteína receptora p185 neu puede subdividirse en tres dominios: el dominio extracelular (dominio EC), el dominio transmembrana (dominio TM) y el dominio intracitoplasmático (dominio IC). Recientemente, se ha publicado la estructura cristalográfica del dominio EC de la proteína p185 neu de rata y ser humano. Se ha descrito que este dominio está compuesto por cuatro subdominios (I/L1, II/CR1, III/L2 y IV/CR2) para aproximadamente 630 aminoácidos en total. Se ha mostrado además que la proteína p185 neu tiene una conformación rígida, que le permite interaccionar con otros receptores ErbB, dimerizarse e inducir la transducción de la señal de proliferación incluso si esta proteína no se une directamente a los ligandos (Cho et al., 2003, Nature 421: 756). El oncogén Her-2/neu (ErbB2) está implicado en procesos normales de organogénesis embrionaria y crecimiento epitelial, mientras que en adultos se expresa sólo a escasos niveles (Press et al., 1990, Oncogene 5: 953). En seres humanos, la sobreexpresión de este oncogén está provocada principalmente por amplificación génica. El oncogén Her-2/neu (ErbB2) se sobreexpresa en aproximadamente el 30% de los carcinomas de mama, y una sobreexpresión de este tipo está relacionada con una evolución del tumor más rápida (Slamon et al., 1989, Science 244: 707). Entre las diferentes estrategias que se han propuesto, la vacunación con ADN parece ser un método eficaz para provocar una respuesta inmunitaria frente a tumores positivos para Her-2/neu. Aún cuando la proteína p185 neu es un auto antígeno, es decir, una proteína que está presente normalmente en el organismo, los pacientes con carcinomas de mama positivos para p185 neu a menudo presentan una respuesta inmunitaria, tanto celular como humoral (Signoretti et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. 23: 1918; Disis et al., 1994, Cancer Res. 54: 16; Peoples et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 432). Uno de los objetivos de las inmunoterapias antitumorales dirigidas hacia la proteína p185 neu es aumentar la intensidad de la respuesta en pacientes con una respuesta inmunitaria preexistente, o generar una respuesta inmunitaria en pacientes en los que esta respuesta es indetectable. El hecho de que una proteína p185 neu sea un auto antígeno conlleva que la vacuna debe poder superar un estado inmunotolerante. Los inventores de la presente solicitud de patente fueron los primeros en usar y validar la eficacia de la vacunación con ADN para provocar una protección inmunitaria frente a tanto carcinomas de mama espontáneos como tumores positivos para Her-2/neu trasplantables. Estos estudios han comprobado que la prevención y el tratamiento de lesiones preneoplásicas es un objetivo accesible. En particular, en experimentos dirigidos a prevenir el desarrollo de tumores de mama espontáneos que surgen en ratones transgénicos debido al oncogén Her-2/neu de rata (ratones FVB/neuT y ratones BALB-neu), se ha mostrado que el plásmido que codifica para los dominios EC y TM de la proteína p185 neu de rata puede provocar una protección más eficaz en comparación con el plásmido que codifica para la proteína p185 neu de longitud completa o el plásmido que codifica para su dominio EC sólo (antígeno secretado) (Amici et al., 2000, Gene Ther. 7: 703; Rovero et al., 2000, J. Immunol. 165: 5133). Se han notificado 2 E08004513 26-10-2011   datos similares por Chen et al., (1998, Cancer Res. 58: 1965). Además, se ha mostrado que la eficacia de la vacunación con plásmidos de ADN aumenta fuertemente si va seguida de un pulso eléctrico muy corto cuando se inoculan los plásmidos por vía intramuscular (Quaglino et al., 2004, Cancer Res. 64: 2858). Otros autores han mostrado que los plásmidos que codifican para la proteína p185 neu de longitud completa, si es necesario mutada de manera que no tenga actividad tirosina cinasa, son eficaces en la prevención de la aparición de tumores tras el trasplante de células cancerosas positivas para p185 neu (Wei-Zen et al., 1999, Int. J. Cancer 81: 748). Los mismos plásmidos han demostrado ser tan eficaces incluso cuando, privados de la señal líder responsable del procesamiento de la proteína en el retículo endoplasmático, provocan la localización citoplásmica del antígeno de p185 neu . Cuando se usan plásmidos que codifican para la proteína p185 neu que se localiza en la membrana gracias a la presencia de una señal líder, las protecciones dependen de una respuesta inmunitaria que se basa en anticuerpos. Por el contrario, se observa una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T si la vacuna no contiene una señal líder, y por tanto la proteína p185 neu se localiza en el citoplasma de células transfectadas en vez de en su membrana plasmática (Pilon et al., 2001, J. Immunol. 167: 3201). Además, una vacunación combinada obtenida usando tanto plásmidos con una señal líder como aquellos en los que esta señal líder se ha delecionado, es más eficaz en la protección contra el crecimiento tumoral (Piechocki et al., 2001, J. Immunol. 167: 3367). Esto demuestra que existe un efecto sinérgico entre las respuestas humoral y celular en la prevención de carcinomas positivos para p185 neu (Reilly et al., 2001, Cancer Res. 61: 880). La vacunación con el plásmido que codifica para los dominios EC y TM (plásmido EC-TM) ha demostrado ser eficaz no sólo en la prevención del desarrollo de carcinomas positivos para p185 neu espontáneos, sino también en el tratamiento de masas tumorales de 2 mm de diámetro implicando una gama de mecanismos del sistema inmunitario efector (células T cooperadoras y células T citotóxicas, anticuerpos, macrófagos, neutrófilos, células citotóxicas naturales, receptores de Fc, IFN-gamma y perforinas), que contribuyen de manera coordenada al rechazo del tumor (Curcio et al., 2003, J. Clin. Invest. 111: 1161). El documento WO 00/44899 A da a conocer proteínas de fusión de ser humano-rata de HER2/Neu que contienen diversas combinaciones de dominios EC y IC de HER2/Neu de ser-humano y rata, incluyendo el dominio de fosforilación que está dentro del dominio IC. Se indica que las proteínas de fusión son útiles para la inmunización de animales de sangre caliente contra tumores malignos asociados con el oncogén HER-2/neu. Descripción de la invención Se han construido varios plásmidos que codifican para el dominio TM de longitud completa y partes decrecientes del dominio EC de la proteína p185 neu de rata. Se usaron los plásmidos truncados, obtenidos mediante la deleción de los 240 pares de bases (pb) NH2-terminales, o múltiplos de esta longitud, en experimentos dirigidos a prevenir... [Seguir leyendo]

1. Vector de plásmido para la transferencia de ADN, plásmido que contiene una secuencia que consiste en SEQ ID N: 10 que codifica para una proteína p185 neu quimérica. 2. Vector de plásmido según la reivindicación 1, que contiene además un promotor de la transcripción. 3. Vector de plásmido según la reivindicación 2, en el que dicho promotor es el promotor de CMV. 4. Vector de plásmido según las reivindicaciones 1-2, que es adecuado para su uso en mamíferos, particularmente en seres humanos. 5. Composición farmacéutica que contiene un vector de plásmido según las reivindicaciones 1-3, junto con excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables. 6. Composición según la reivindicación 5, que es adecuada para la administración parenteral. 7. Composición según la reivindicación 6 en forma de una disolución inyectable. 8. Composición según la reivindicación 5 en forma de una vacuna de ADN. 9. Uso de un vector de plásmido según las reivindicaciones 1-4 para la preparación de un agente terapéutico que va a usarse en la prevención o el tratamiento de sujetos en riesgo de desarrollar tumores positivos para p185 neu , o pacientes que portan tumores primarios, metástasis o recidivas de tumores positivos para p185 neu . 10. Uso según la reivindicación 9 para la preparación de una vacuna de ADN. 16 E08004513 26-10-2011   17 E08004513 26-10-2011   18 E08004513 26-10-2011   19 E08004513 26-10-2011   E08004513 26-10-2011   21 E08004513 26-10-2011   22 E08004513 26-10-2011   23 E08004513 26-10-2011   24 E08004513 26-10-2011   E08004513 26-10-2011   26 E08004513 26-10-2011   27 E08004513 26-10-2011   28 E08004513 26-10-2011   29 E08004513 26-10-2011   E08004513 26-10-2011