Planta transgénica RC15 resistente al frio y estrés salino productora de TMAO,

elementos necesarios para su obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir tolerancia al frio y estrés salino.La presente invención describe una planta transgénica resistente al frio y al estrés salino basada en el uso de un nuevo gen, el gen RC15, codificante de una enzima monoxigenasa que induce la aparición de TMAO. Además la invención proporciona secuencia de nucleótidos, vectores y células necesarias para llevar a cabo el procedimiento para obtener dichas plantas transgénicas. Finalmente, se añade el uso de composiciones que contienen TMAO para la mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas mediante la aplicación exógena de dichas soluciones sobre la planta o semilla, por ejemplo pulverización o inyección

Planta transgénica RCI5 resistente al frío y estrés salino productora de TMAO, elementos necesarios para su obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir tolerancia al frío y estrés salino.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia al frío y al estrés salino de una planta alterando la expresión del gen RCI5. En particular, la presente invención proporciona una planta transgénica que tiene un mayor nivel de la proteína RCI5 en relación con una planta no transgénica, y el uso de composiciones que contienen TMAO para la mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas, mediante la aplicación de las soluciones que contengan dicho compuesto por cualquier vía que ponga en contacto la composición de la invención con cualquier parte de la planta y/o semillas.

Estado de la técnica

Las temperaturas de congelación constituyen uno de los principales factores ambientales que limitan el crecimiento, productividad y distribución geográfica de las plantas (Boyer, 1982). Muchas especies de climas templados han adquirido a lo largo de la evolución una respuesta adaptativa que les permite enfrentarse a las temperaturas de congelación. Por medio de esta respuesta, conocida como aclimatación al frío (Levitt, 1980), las plantas adquieren una tolerancia a las temperaturas de congelación después de un tiempo de exposición a temperaturas bajas no congelantes. La aclimatación a frío constituye un ejemplo representativo de la interacción de las plantas con su entorno y de como esta interacción ha condicionado la evolución de algunas especies. El esclarecimiento de los mecanismos moleculares que controlan este proceso adaptativo no es solo interesante desde el punto de vista básico, para entender como crecen y se desarrollan las plantas, sino que además tiene un gran potencial biotecnológico en la obtención de herramientas moleculares para mejorar la tolerancia a la congelación de cultivos muy importantes. Hay que resaltar que, diferentes trabajos han mostrado que la aclimatación a las temperaturas bajas también aumenta la tolerancia de las plantas a otros estreses abióticos como deshidratación y estrés salino. Por tanto, el estudio de la aclimatación a frío debería aportar información esencial de como las plantas responden de manera coordinada a diferentes condiciones ambientales adversas

El proceso de aclimatación a frío es muy complejo y conlleva numerosos cambios a nivel bioquímico y fisiológico, incluyendo cambios en la membrana lipídica (Uemura et al., 1995), síntesis de nuevas proteínas (Kawamura y Uemura, 2003), incremento del contenido endógenos de ABA (Lang et al., 1994), y la acumulación de solutos compatibles (Wanner y Junttila, 1999). Cada vez hay mas pruebas que muestran que la mayoría de estos cambios son controlados a través de una extensa reprogramación de la expresión génica (Salinas 2002; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2006; Welling y Palva, 2006). De hecho, estudios recientes usando la tecnología de microarrays han revelado que la expresión de cientos de genes cambia en respuesta a las temperaturas bajas, indicando que la aclimatación a frío esta mediada por múltiples rutas (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008; Chawade et al., 2007). Muchos de estos genes también son regulados por deshidratación y salinidad (Matsui et al., 2008), confirmando a nivel molecular la estrecha relación existente en las repuestas de la planta a estos estreses abióticos. Como ejemplo de esto sirve un grupo de genes que contienen el motivo CCGAC en su promotor, que es la secuencia central del elemento de regulación en cis CRT/DRE (C-repeat/dehydration-responsive element) (Baker et al., 1994; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994). El motivo CCGAC es suficiente para mediar la respuesta de la expresión génica a frío, deshidratación y estrés salino (Baker et al., 1994; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994), e interacciona específicamente con la familia de factores transcripcionales denominados CBF/DREB (C-repeat Binding Factor/DRE Binding protein) (Stockinger et al., 1997; Liu et al., 1998). Tres genes correspondientes a miembros de esta familia (CBF1/DREB1B, CBF2/DREB1C, CBF3/DREB1A) son inducidos rápidamente por temperaturas bajas (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998; Medina et al., 1999), mientras que la expresión de otros dos (DREB2A, DREB2B) responde principalmente a deshidratación y estrés salino (Liu et al., 1998).

Desafortunadamente, sin embargo, a pesar del gran número de genes que se han identificado cuya expresión es regulada por frío, las funciones celulares y metabólicas de la mayoría de los mismos, así como su implicación en la aclimatación a frío, son todavía desconocidos. El análisis de las secuencias de algunos de estos genes sugiere que deben estar implicados en la protección de la célula produciendo proteínas funcionales, mientras que otros genes codificarían proteínas con alguna función en la regulación de la expresión génica y en la transmisión de la señal (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008; Chawade et al., 2008). Las proteínas funcionales incluyen enzimas para la producción de osmolitos compatibles, enzimas relacionadas con el quenching de especies reactivas de oxigeno (ROS), chaperonas que protegerían las proteínas y las membranas, y canales iónicos y de agua para el mantenimiento de la homeostasis iónica y del agua. Entre las proteínas reguladoras, además de los factores de transcripción, se encuentran proteínas de unión a RNA, de unión a calcio, proteínas kinasas y fosfatasas, encimas implicadas en el reciclaje de fosfoinositoles y otras moléculas señalizadoras (Matsui et al., 2008). La caracterización de la función de los genes regulados por frío y de su implicación en el proceso de aclimatación debería contribuir al entendimiento de los mecanismos que gobiernan este proceso adaptativo.

Estreses abioticos ambientales, como las temperaturas de congelación y el estrés salino, se encuentran entre los problemas más importantes para una agricultura sostenible a nivel mundial. En los últimos años, se han realizado grandes esfuerzos para entender la respuesta a nivel molecular a estos estreses, lo cual a facilitado la identificación de genes implicados en la tolerancia a las temperaturas de congelación y al estrés salino (Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 2007). Sin embargo, aun se ha de aclarar como son percibidas las señales físicas y como son convertidas en señales bioquímicas.

Descripción de la invención

Un aspecto de la invención lo constituye una planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino, en adelante planta transgénica RCI5 de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y

ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a).

Un aspecto particular de la presente invención lo constituye una planta transgénica de la presente invención en la que la secuencia de nucleótidos, que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), es el gen RCI5 de SEQ ID NO: 1. Una realización particular de ésta es la planta transgénica de Arabidopsis RCI5-OE generada en la presente invención (ver Ejemplo 1.2 y Materiales y Métodos).

Otro aspecto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de la planta transgénica RCI5, en adelante procedimiento de obtención de una planta transgénica de la invención, que consiste en la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos constituida por:

i.- una secuencia de nucleótidos codificante de proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), y

ii.-... [Seguir leyendo]

1. Planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y

ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a).

2. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 1.

3. Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la planta es Arabidopsis, preferentemente la planta transgénica RCI5-OE, que contiene la SEQ ID NO: 1

4. Procedimiento de obtención de la planta transgénica según las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque consiste en la introducción en una planta de una secuencia de nucleótidos constituida por:

i.- una secuencia de nucleótidos codificante de proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), y

ii.- una secuencia de nucleótidos promotora que permite y regula la expresión de la secuencia de i.- y la aparición de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la célula.

5. Procedimiento según la reivindicación 4 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) obtención de un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos del gen RCI5 SEQ ID NO: 1,

b) obtención de microorganismos portadores del vector a), y

c) transformación de las plantas con el vector de a) o con el microorganismo de b).

6. Una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:

a) la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin

b) una secuencia de nucleótidos promotora que permite y regula la expresión de la secuencia de a) y la aparición de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la célula.

7. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de a) está constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1.

8. Vector de expresión génica caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 y que permite la transformación o transfección de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas transgénicas de la invención.

9. Vector de expresión según la reivindicación 8 caracterizado porque es el vector 35S::RCI5.

10. Microorganismo o célula caracterizado porque contiene la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las reivindicaciones 8 y 9.

11. Semilla de una planta caracterizada porque contiene la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las reivindicaciones 8 y 9.

12. Uso de una composición acuosa que comprende el compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo para inducir tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas y/o semillas.

13. Uso de una composición según la reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa comprende el compuesto TMAO en una concentración comprendida entre 1 μM y 100 mM, preferentemente entre 50 μM y 1 mM, y más preferentemente a 100 μM.

14. Uso de una composición según la reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa de TMAO es de 100 μM.

15. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica mediante pulverización a la parte aérea.

16. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica al tallo por inyección.

17. Uso de una composición según las reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la composición acuosa se aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al agua de riego (o solución de cultivo) o por inmersión del sistema radicular de las plantas y/o de semillas.