MOLÉCULAS DE UNIÓN CAPACES DE NEUTRALIZAR EL VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Y USOS DE LAS MISMAS.

Moléculas de unión capaces de neutralizar el virus del Nilo occidental y usos de las mismas CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la medicina. En particular la invención se refiere al diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de infección por el virus del Nilo occidental (WNV). ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus del Nilo occidental (WNV) es un miembro de la familia Flaviviridae, género Flavivirus. Los flavivirus son pequeños virus de ARN de cadena positiva con envoltura esférica. El género Flavivirus comprende más de 60 virus altamente relacionados que incluyen varios patógenos humanos como, entre otros, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis de St. Louis, el virus de la encefalitis del valle del Murray, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas y el virus del dengue. El WNV fue aislado inicialmente en 1937 en la región del Nilo occidental de Uganda pero actualmente tiene una distribución casi mundial que incluye partes de África, Asia, Australia, Europa y, más recientemente, Norteamérica. El WNV fue diagnosticado por primera vez en el área de Nueva York en 1999 y ha seguido extendiéndose rápidamente por Norteamérica causando infecciones en personas de más de 40 estados diferentes hasta llegar hasta California. El WNV es transmitido principalmente al hombre por mosquitos pero en ocasiones la transmisión se ha vinculado 25 con transfusiones sanguíneas y trasplante de órganos. Las infecciones por el WNV tienen generalmente síntomas leves, que duran generalmente de 3 a 6 días, variando desde una fiebre de inicio súbito, cefalea, temblores y erupción cutánea hasta inflamación de las glándulas linfáticas. Sin embargo, en el 30% de los casos, especialmente en ancianos y pacientes inmunodeprimidos, la enfermedad progresa a un estado más grave (por ejemplo, encefalitis o meningitis aséptica), que puede conducir a la muerte. En 2002, la mortalidad humana aumentó en más de 150 30 casos. Además de infectar a los seres humanos, se sabe también que el WNV infecta a caballos y varias especies de aves y puede provocar afecciones graves y la muerte en dichas especies.   Las dos estrategias principales para prevenir las infecciones por el WNV son a) controlar la difusión del WNV por el rociado de grandes áreas con insecticidas para destruir los mosquitos que actúan como vectores y b) reducir el contacto entre seres humanos y mosquitos usando protección personal como repelentes antiinsectos. Estas estrategias son, sin embargo, altamente ineficaces. Además, existe inquietud en relación con los efectos tóxicos de los insecticidas. Por otra parte, el rociado requiere aplicaciones repetidas y se considera poco fiable, ya que no proporciona una cobertura completa de las áreas de cría del mosquito o erradicación de los mosquitos. 40 No existe ningún tratamiento específico de la infección por el WNV. El tratamiento ha sido sólo de apoyo, ya que no existen fármacos antivíricos u otros fármacos disponibles con eficacia demostrada. Entre las opciones de tratamiento potenciales más prometedoras disponibles actualmente para seres humanos se incluyen los compuestos antivíricos ribavirina e interferón-alfa2b (Anderson y Rahal, 2002), y las inmunoglobulinas anti-WNV humanas (Ben Nathan y col., 2003). Un inconveniente asociado a la ribavirina y el interferón-alfa2b reside en sus toxicidades importantes. Un 45 inconveniente de las inmunoglobulinas anti-WNV es que no están disponibles en cantidades suficientes y son demasiado caras. Además, la posibilidad de contaminación por patógenos conocidos o desconocidos es una preocupación adicional asociada a las inmunoglobulinas anti-WNV. Además, en el documento WO-02/072.036 se ha sugerido que la proteína E del WNV puede usarse para preparar anticuerpos monoclonales anti-WNV murinos, y se demostró que la inmunización pasiva con sueros que contienen dichos anticuerpos puede alterar la susceptibilidad al 50 WNV en ratones. Sin embargo, los anticuerpos murinos, en formato desnudo o inmunoconjugado, son limitados para su uso in vivo debido a problemas asociados con la administración de anticuerpos murinos a seres humanos, como la corta vida media del suero, la incapacidad para desencadenar ciertas funciones de efector humano y el desencadenamiento de una respuesta inmunitaria espectacular no deseada frente al anticuerpo murino en un ser humano. En consecuencia, existe una necesidad urgente de un medicamento adecuado para detección, prevención 55 y/o tratamiento de infecciones por el WNV. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La fig. 1 muestra el mapa de dominios de la proteína E del WNV que se une a los scFv. En el eje X se muestran los 2 E05821472 11-10-2011   scFv sometidos a ensayo y en el eje Y se suministra el valor de DO a 492 nm. Las barras negras muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV murino 6B6C-1, las barras rayadas (en sentido ascendente de izquierda a derecha) muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti- WNV murino 7H2, las barras rayadas (en sentido ascendente de derecha a izquierda) muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV 4G2 y las barras sobre fondo blanco muestran ELISA de competición de los scFv con el anticuerpo monoclonal anti-WNV 3A3. La fig. 2 muestra la valoración del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4374 en un modelo de provocación de WNV murino. Se muestra valoración de arriba abajo del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4374 mediante el uso de dosis de 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 y 0,003 mg/kg y valoración con un anticuerpo de control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de supervivencia (%). La fig. 3 muestra la valoración del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4353 en un modelo de provocación de WNV murino. Se muestra valoración de arriba abajo del anticuerpo monoclonal anti-WNV CR4353 mediante el uso de dosis de 10, 3, 1, 0,1, 0,3 y 0,03 mg/kg y valoración con un anticuerpo de control a una concentración de 10 mg/kg. En el eje X se muestran los días y en el eje Y se representa la probabilidad de supervivencia. Fig. 4. Clasificación de afinidades de anticuerpos usando resonancia de plasmones superficiales. Los anticuerpos con una afinidad relativamente alta por el virus del Nilo occidental están situados en el ángulo superior derecho de esta representación, lo que indica buena asociación y disociación lenta. Para cada anticuerpo se muestra el promedio de dos medidas. Fig. 5. Curva de unión de forma IgM de CR4374 (CRM4374) a partículas semejantes a virus (VLP). Se muestran dos tandas de purificación diferentes ( y , IgM; y , control). Fig. 6. Clasificación de afinidades de variantes de CR4374 con maduración de la afinidad que usan resonancia de plasmones superficiales. Los anticuerpos con una afinidad relativamente alta por el virus del Nilo occidental están situados en el ángulo superior derecho de esta representación, lo que indica buena asociación y disociación lenta. Para cada anticuerpo se muestra el promedio de dos medidas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN A continuación se ofrecen las definiciones de los términos según se usan en la invención. DEFINICIONES Secuencia de aminoácidos El término "secuencia de aminoácidos" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a moléculas sintéticas o de ocurrencia natural y a una secuencia de péptidos, oligopéptidos, polipéptidos o proteínas. Molécula de unión Según se usa en la presente memoria descriptiva el término "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina 45 intacta que incluye anticuerpos monoclonales, como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende el fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica al compañero de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo el WNV. Con independencia de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que es reconocido por la inmunoglobulina intacta. El término "molécula de unión", según se usa en la presente memoria descriptiva incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en las cinco grandes clases de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases 55 (isotipos) como, por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Entre los fragmentos de unión a antígenos se incluyen, entre otros, Fab, F(ab), F(ab)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de regiones de determinación de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena única (scFv), anticuerpos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína E del virus del Nilo occidental (WNV) y que tiene una actividad de neutralización del WNV, en el que dicho anticuerpo comprende una región CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, una región CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una región CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una región CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 y una región CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. 2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano. 3. Un mutante con maduración de la afinidad de un anticuerpo según la reivindicación 1, que tiene una 15 afinidad superior en comparación con el anticuerpo según la reivindicación 1 y en el que dicho mutante con maduración de la afinidad es capaz de unirse específicamente a la proteína E del WNV y tiene actividad de neutralización del WNV. 4. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3, comprendiendo además el inmunoconjugado al menos una etiqueta. 5. Una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3. 6. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 7. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para su uso como medicamento.   8. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para su uso en el diagnóstico, profilaxis o tratamiento de una dolencia resultante de una infección por el WNV. 9. Un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, un mutante con maduración de la afinidad según la reivindicación 3 o un inmunoconjugado según la reivindicación 4, para el diagnóstico in vitro de una infección por el WNV. 224     226   227   228   229