MODULACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE RETROVIRUS POR APOBEC4.

La invención se refiere a la modulación de la liberación de retrovirus o partículas virales de los mismos desde células por APOBEC4 humana o una APOBEC4 humana modificada y a diversos usos de los mismos. Técnica Antecedente La familia del polipéptido catalítico de tipo 4 de la enzima de edición del ARNm de la apolipoproteína B (APOBEC4) es un miembro de la superfamilia AID/APOBEC específica de vertebrados de citidina desaminasas de edición de ARN/ADN (ROGOZIN, IB, y col. APOBEC4, a new member of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases predicted by computational analysis. Cell Cycle. 2005, vol.4, nº 9, pág. 1281-5). La superfamilia de proteínas AID/APOBEC contiene cinco subfamilias (AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3 y APOBEC4) e incluye varios miembros con la capacidad de desaminar citosina para dar uracilo en polinucleótidos monocatenarios, mientras que cumplen diversas funciones fisiológicas (CONTICELLO, SG, y col. Evolution of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases. Mol Biol Evol. 2005, vol.22, no.367, p.77), entre las que se encuentra la inhibición de retrovirus por mecanismos dependientes e independientes de edición de ácidos nucleicos (HOLMES, RK, y col. APOBEC-mediated viral restriction: not simply editing? Trends Biochem Sci. 2005, vol.32, no.3, p.118-128). Se ha descrito un procedimiento para inactivar enzimas APOBEC por medio del virus espumoso Bet (documento WO 2005/117947), y el documento WO 2006/065377 desvela un procedimiento para la identificación de agentes que reducen el nivel de APOBEC3C activo en una célula. En mamíferos, la expresión de APOBEC4 está regulada positivamente en testículos, lo que sugiere la posibilidad de que sea una enzima de edición para ARNm implicados en la espermatogénesis. Sin embargo, aún se desconoce la función o funciones fisiológicas exactas de APOBEC4. La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de APOBEC4 se conoce y está disponible para diversas especies, entre otras, ser humano (número de acceso del GenBank NM_203454, Gl 44888831), ratón (número de acceso del GenBank NC_000067, Gl 38073497), o rata (número de acceso del GenBank NM_001017492, Gl 62945336). APOBEC4 es una proteína de aproximadamente 370 aminoácidos y 41000 Da (APOBEC4 humana: 367 aminoácidos; 41581 Da) y comprende un dominio de dedo de cinc y, en la mayoría de las especies, una cola de polilisina C terminal. Divulgación de la Invención La invención se refiere a la materia objeto definida en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de la proteína APOBEC4 o una proteína APOBEC4 modificada en una célula que produce un retrovirus conduce a una mayor o menor producción de retrovirus o partículas virales a partir de dicha célula. Específicamente, la estabilización de la proteína por modificación del extremo N, entre otras cosas, mediante adición de una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, el marcador V5, el marcador c-myc o el marcador HA, conduce a una mayor producción de retrovirus o partículas virales desde dicha célula. La modificación del extremo C, entre otras cosas, mediante la adición de al menos un marcador V5, marcador c-myc o marcador HA conduce a una menor producción de retrovirus o partículas virales desde dicha célula. También se desvela que la cola de polilisina C terminal de APOBEC4 puede modificarse por deleción o modificación por mutación. Un primer aspecto de la invención es una proteína APOBEC4 humana modificada caracterizada porque el extremo N está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4 o está modificado el extremo C. La modificación del extremo N comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma. Dicha al menos una secuencia de aminoácidos puede ser HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma. La modificación del extremo C comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma. Más preferentemente, dicha al menos una secuencia de aminoácidos es HA, 3 HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma. Un aspecto adicional de la invención es una célula que expresa la proteína APOBEC4 modificada en el extremo C o N de la presente invención. Preferentemente, la célula produce además un retrovirus. Más preferentemente, el retrovirus o lentivirus se selecciona del grupo que consiste en VIH, VIH-1, VIH-2, VIS, VISagm, VISmac, VIF, VAIE, espumavirus (virus espumoso) y VLM. Incluso más preferentemente, dicho retrovirus o lentivirus es un virus deficiente en la replicación. En una realización preferida adicional, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula humana, una célula HeLa, una célula 293T, una célula madre, un linfocito T auxiliar, un macrófago o progenitores o líneas celulares de los mismos. Otro aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención o el complemento de la misma. En una realización preferida, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 de la presente invención o un complemento del mismo, unido operativamente a un promotor. En una realización más 2   preferida, el ácido nucleico es un vector para terapia génica. En una realización adicional más preferida, el promotor es el promotor de CMV. Otro aspecto de la presente invención es el uso de la secuencia de ácido nucleico o célula de la presente invención para la producción de un medicamento. En una realización preferida, el ácido nucleico es un vector para terapia génica y/o un ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención unido operativamente a un promotor, preferentemente el promotor de CMV. En una realización preferida adicional, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención. En otra realización preferida, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención y además produce un retrovirus o partículas de virus del mismo, preferentemente un retrovirus deficiente en la replicación, más preferentemente un virus deficiente en la replicación seleccionado del grupo que consiste en VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, espumavirus o partículas de virus de los mismos. En un aspecto adicional, el medicamento se dirige al tratamiento o vacunación contra VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, espumavirus, VISagm y VISmac. Otro aspecto de la invención es el uso de una partícula viral de la invención para la preparación de un medicamento, preferentemente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales. En una realización preferida, las partículas virales comprenden una proteína APOBEC4 modificada en el extremo C de la invención, preferentemente la proteína APOBEC4-HA o APOBEC4-3xHA. En otra realización preferida, las partículas virales se basan en un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, VIS, VLM, VIF, VAIE, VIH-1, VIH-2, VISagm, VISmac, espumavirus, preferentemente VIH-1. En una realización preferida adicional, las partículas virales son partículas virales seudotipificadas. En otra realización de la presente invención, la partícula viral codifica ARNhc/ip que se dirige a la APOBEC4 endógena y codifica adicionalmente una APOBEC4 terapéutica de codones optimizados, por ejemplo, APOBEC-3xHA o APOBEC-HA, que no se ve afectada por las moléculas de ARNhc/ip. Otro aspecto de la presente invención es una vacuna que comprende la célula de la presente invención y un vehículo farmacéutico aceptable. En una realización preferida, la célula expresa la proteína APOBEC4 modificada de la presente invención, estando la proteína APOBEC4 modificada en el extremo N para estabilizar la proteína APOBEC4 y produciendo además un retrovirus o partículas de virus del mismo, preferentemente un retrovirus o lentivirus deficiente en la replicación. En una realización preferida adicional, la célula es una célula madre o una célula autóloga, una célula T auxiliar o un macrófago. Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para reducir la producción de retrovirus o partículas virales de los mismos en una célula que produce un retrovirus o partículas virales del mismo, comprendiendo el procedimiento a expresar una proteína APOBEC4 modificada de la presente invención en dicha célula, en el que el extremo C de la proteína APOBEC4 está modificado para reducir o inhibir la unión a la cola... [Seguir leyendo]

1. Una proteína APOBEC4 humana modificada caracterizada porque el extremo N está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4 o el extremo C está modificado, en la que la modificación del extremo N comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c- myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma, y en la que la modificación del extremo C comprende la adición de al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el marcador V5, el marcador c-myc y el marcador HA o una secuencia de aminoácidos homóloga a la misma. 2. La proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos una secuencia de aminoácidos añadida al extremo N es un marcador HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma. 3. La proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos una secuencia de aminoácidos añadida al extremo C es el marcador HA o 3 marcadores HA o una secuencia al menos un 90% idéntica a la misma. 4. Una célula que expresa la proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1-3. 5. La célula de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la célula produce además un retrovirus o partículas virales del mismo. 6. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el retrovirus es un lentivirus y/o es un virus deficiente en la replicación. 7. La célula de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el extremo N de la proteína APOBEC4 está modificado para estabilizar la proteína APOBEC4. 8. La célula de acuerdo con las reivindicaciones 4-7, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula 293T, una célula HeLa, una célula T auxiliar y un macrófago. 9. Un ácido nucleico que codifica la proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el complemento de la misma. 10. Un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9. 11. Un ácido nucleico o un vector para terapia génica somática que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico que codifica APOBEC4 está unido operativamente a un promotor. 12. Una vacuna que comprende la célula de acuerdo con la reivindicación 7 y un vehículo farmacéutico aceptable. 13. Una partícula retroviral deficiente en la replicación que comprende el ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, en la que el ácido nucleico es un ARN. 14. La partícula retroviral de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la partícula retroviral procede de VIH, VIH-1, VIH-2, VIS, VISagm, VISmac, espuma virus, VIF, VAIE o VLM. 15. Un procedimiento in vitro para reducir la producción de retrovirus o lentivirus o partículas virales de los mismos de una célula que produce un retrovirus, lentivirus o partículas de vector de los mismos, comprendiendo el procedimiento expresar una proteína APOBEC4 modificada de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 3 en dicha célula, en la que el extremo C de la proteína APOBEC4 está modificado. 16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la producción de retrovirus o partículas virales de los mismos se reduce al menos un 20%. 17. Un procedimiento para producir partículas retrovirales, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 7. 18. El uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 7, del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o de la partícula retroviral de acuerdo con las reivindicaciones 13-14 para la fabricación de un medicamento. 19. El uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 7, del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o de la partícula retroviral de acuerdo con las reivindicaciones 13-14 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o vacunación contra una infección por un retrovirus. 20. Un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de: poner en contacto una célula que expresa una proteína APOBEC4 humana con un compuesto de ensayo; y determinar si el compuesto de ensayo afecta a la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de dicha célula, en el que una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de dicha célula indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral. 39   21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una primera célula en presencia de un compuesto de ensayo se compara con la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de una segunda célula en ausencia de dicho compuesto de ensayo, en el que una reducción en la transcripción y/o expresión de APOBEC4 de la primera célula en comparación con la segunda célula indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral. 22. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 ó 21, en el que la transcripción y/o expresión de APOBEC4 se determina por RT-PCR, transferencia de Northern y/o transferencia de western. 23. Un procedimiento para seleccionar compuestos antivirales, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto una célula que expresa un retrovirus y una proteína APOBEC4 con un compuesto de ensayo; y determinar el título del retrovirus en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, en el que una reducción en el título indica que el compuesto de ensayo es un compuesto antiviral. 24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en el que el compuesto de ensayo es una molécula de ARNip o ARNhc dirigida contra el ARNm de APOBEC4.   41   42   43   44     46