Método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

introducir la muestra en un dispositivo de detección basado en la difracción; transmitir una fuente luminosa a través del dispositivo de detección basado en la difracción o reflejar una fuente luminosa desde el mismo, para generar una imagen de difracción; y examinar la imagen de difracción con un analizador; en el que el analizador está adaptado para transmitir o reflejar la fuente luminosa; medir la intensidad de la luz procedente de la imagen de difracción; y utilizar un algoritmo para determinar si el analito está presente en la muestra; caracterizado porque dicho algoritmo comprende: (intensidad de la luz difractada a órdenes segundo y superiores)/(intensidad de la luz entrante)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está, en general, en el campo de la detección de analitos en un medio y, más en concreto, la presente invención se refiere a los métodos de examen y/o de análisis en dispositivos de diagnóstico basados en la difracción, que pueden indicar la presencia del analito en un medio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existen muchos sistemas y dispositivos que pueden detectar una amplia variedad de analitos en diversos medios. Por ejemplo, los documentos W0 01/71322 y WO 96/12962 dan a conocer métodos y aparatos para llevar a cabo ensayos de difracción. El documento WO 01/81921 da a conocer un proceso para fabricar biodetectores basados en la difracción, utilizando impresión por chorro de tinta. El documento GB 2273772 da a conocer un proceso para la detección de macromoléculas utilizando la difracción de la luz. Finalmente, el documento USA 5.089.387 da a conocer un ensayo de difracción de una sonda de DNA, con las características del preámbulo de la reivindicación 1.

La mayoría de estos sistemas y dispositivos son relativamente costosos y requieren un técnico cualificado para llevar a cabo la prueba. Existen muchos casos en los que sería ventajoso poder determinar de forma rápida y económica si está presente un analito. Lo que se necesita es un sistema que sea de fabricación sencilla y económica, y que pueda realizar una detección fiable y sensible de los analitos.

Sandstrom y otros, en 24 Applied Optics (Óptica aplicada)472, 1985, describen la utilización de un sustrato óptico de silicio con una capa de monóxido de silicio y una capa de silicio formadas como películas dieléctricas. Los autores indican que un cambio en el grosor de la película cambia las propiedades del sustrato óptico, produciendo diferentes colores relacionados con el grosor de la película. El grosor de la película está relacionado con el color observado, y una película dispuesta sobre un sustrato óptico puede producir un cambio de color visible. Los autores indican que se puede utilizar un modelo matemático para cuantificar el cambio de color, y que "los cálculos llevados a cabo utilizando el modelo informático muestran que es muy poco lo que puede ganarse en el comportamiento óptico a partir de la utilización de una estructura multicapa... pero una biocapa sobre la superficie cambia muy poco la reflexión de dichas estructuras puesto que las propiedades ópticas están determinadas principalmente por las interfaces en el interior de la estructura multicapa. El sistema más sensible para la detección de biocapas es un recubrimiento de una sola capa, mientras que en la mayoría de las otras aplicaciones el rendimiento puede mejorarse mediante capas dieléctricas adicionales".

Sandstrom y otros, prosiguen indicando que las placas formadas a partir de óxidos metálicos sobre metal tienen ciertos inconvenientes, y que la presencia de iones metálicos puede asimismo ser nociva en muchas aplicaciones bioquímicas. Indican que la película dieléctrica superior ideal es de un grosor de 2 a 3 nm de dióxido de silicio, que se forma espontáneamente cuando se deposita una capa de monóxido de silicio en la atmósfera ambiente, y que puede utilizarse una capa de 70 a 95 nm de dióxido de silicio sobre una capa de 40 a 60 nm de monóxido de silicio sobre un sustrato de vidrio o plástico. Describen asimismo la formación de una cuña de monóxido de silicio mediante el decapado selectivo del monóxido de silicio, el tratamiento de la superficie de dióxido de silicio con dimetildiclorosilano, y la aplicación de una biocapa de un antígeno y un anticuerpo. A partir de esta construcción de cuña consiguieron determinar el grosor de la película con un elipsómetro, y observaron que "el contraste máximo se encontró en la región de unos 65 nm, donde el color de interferencia cambió de violeta a azul."

La patente de EE.UU. 5.512.131, concedida a Kumar y otros, da a conocer un dispositivo que comprende un sustrato polimérico con un recubrimiento metálico. Se estampa sobre el sustrato recubierto una capa receptora específica de un analito. El dispositivo se utiliza en un proceso de estampado o como un conmutador. Cuando un analito se aglutina al dispositivo se genera una imagen de difracción. A continuación, se utiliza un dispositivo de visualización, tal como un espectrómetro, para determinar la presencia de la imagen de difracción.

Sin embargo, el dispositivo descrito por Kumar y otros tiene varias desventajas. Una desventaja consiste en que es necesario un aparato complejo de visualización para examinar cualquier imagen de difracción.

La patente de EE.UU. número 5 482 830, de Bogart y otros, describe un dispositivo que comprende un sustrato que tiene una superficie ópticamente activa que presenta un primer color como respuesta a la incidencia de luz sobre la misma. Este primer color se define como una distribución espectral de la luz emanada. El sustrato presenta asimismo un segundo color que es diferente al primer color (teniendo una combinación de longitudes de onda de la luz, que difiere de la combinación presente en el primer color, o teniendo una distribución espectral diferente). El segundo color se presenta como respuesta a la misma longitud de onda cuando el analito está presente sobre la superficie. El cambio entre un color y otro puede medirse mediante la utilización de un instrumento, o bien visualmente. Dicha detección de precisión es un avance sobre los dispositivos descritos por Sandstrom y Nygren, indicados más arriba, y permite la utilización de dispositivos de una manera viable y competitiva comercialmente.

Sin embargo, el método y el dispositivo descritos en la patente de Bogart y otros tiene varias desventajas. Una desventaja es el coste elevado del dispositivo. Otro problema del dispositivo es la dificultad para controlar las diversas capas que están situadas en la oblea de manera que se obtenga una lectura fiable.

La patente WO 94/13835, concedida a Bogdanski y otros, describe un método y un sistema para detectar macromoléculas. El sistema comprende una sonda que es una sustancia formadora, de dimensiones predeterminadas de tal manera que difracta la luz en un patrón conocido. Tras aglutinarse mediante una macromolécula (por ejemplo, un analito), la posición de los picos de difracción cambiará debido a esta aglutinación.

Por lo tanto, el sistema debe comprender un detector y un analizador más complejos para detectar cambios en un patrón de difracción. Por comparación, el sistema actual descrito basado en la difracción, está detectando la formación de una imagen o patrón de difracción, de manera que debe ser detectada solamente la aparición de la luz difractada. Por lo tanto, una desventaja del método y sistema descritos por Bogdanski y otros es que se necesita un aparato más complejo para detectar cambios en el patrón de difracción. Otra desventaja consiste en los métodos más complejos necesarios para preparar la sonda, que incluyen una serie de etapas con etapas de fotoprotección y/o de decapado llevadas a cabo sobre una superficie frágil de dióxido de silicio; estos métodos no son aplicables a un proceso de fabricación a escala real debido a los costos de inversión a gran escala.

La patente de EE.UU. número 5.196.350, de Backman y otros, describe un método de detección óptica que utiliza un dispositivo de inmunoensayo junto con una máscara que produce un patrón de difracción. El dispositivo de inmunoensayo está dispuesto entre la máscara y la fuente luminosa, de manera que la aglutinación mediante el analito provoca un cambio en el patrón de interferencia o difracción provocado por la máscara. De este modo, esta patente tiene desventajas similares a la patente de Bogdanski, puesto que utiliza un método basado en detectar cambios en un patrón de difracción debidos a la aglutinación, en vez de la formación de un patrón. Esto hace el análisis más complejo, puesto que estos cambios son más sutiles que un simple sí/no de una imagen de difracción formada en presencia de un analito.

La patente de EE.UU. número 4 992 385, de Godfrey y otros, describe un método para preparar una rejilla de difracción con una película delgada polimérica, para su utilización posterior como dispositivo de detección. A continuación, el dispositivo de detección requiere la utilización de una técnica espectrofotométrica durante el ensayo, para detectar cambios en sus propiedades ópticas debidos a la aglutinación de un analito. De este modo, igual que con las dos patentes anteriores,... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de: introducir la muestra en un dispositivo de detección basado en la difracción; transmitir una fuente luminosa a través del dispositivo de detección basado en la difracción o reflejar

una fuente luminosa desde el mismo, para generar una imagen de difracción; y

examinar la imagen de difracción con un analizador;

en el que el analizador está adaptado para transmitir o reflejar la fuente luminosa; medir la intensidad

de la luz procedente de la imagen de difracción; y utilizar un algoritmo para determinar si el analito está presente en la muestra; caracterizado porque dicho algoritmo comprende: (intensidad de la luz difractada a órdenes segundo y superiores)/(intensidad de la luz entrante).

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de detección basado en la difracción comprende:

una película polimérica; y

una capa receptora con patrón impresa sobre la película polimérica, en el que la capa receptora tiene un material receptor en la misma, que se aglutina específicamente a un analito.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que el material receptor está seleccionado entre antígenos, anticuerpos, nucleótidos, quelantes, enzimas, bacterias, levaduras, hongos, virus, pili bacterianos, material flagelar bacteriano, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, proteínas, carbohidratos, metales, hormonas y receptores para dichos materiales.

4. Método, según la reivindicación 2, en el que se utilizan elementos aumentadores de la difracción específicos para el analito.

5. Método, según la reivindicación 1, en el que el analizador comprende: una fuente luminosa; un fotodetector; un microprocesador; un sistema de visualización; y un cuerpo envolvente para contener la fuente luminosa, el fotodetector, el microprocesador y el

sistema de visualización.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que la fuente luminosa está en el espectro visible.

7. Método, según la reivindicación 5, en el que la fuente luminosa se selecciona entre una luz LED, una luz láser, un diodo láser, a través de fibra óptica, luz natural a través de un poro, o una bombilla basada o no en un filamento.

8. Método, según la reivindicación 5, en el que la fuente luminosa comprende luz reflejada.

9. Método, según la reivindicación 5, en el que el microprocesador comprende además un elemento de soporte lógico para hacer funcionar el algoritmo con el objeto de determinar si está presente un analito en la muestra en función de la medición procedente del fotodiodo.

10. Método, según la reivindicación 5, en el que el sistema de visualizador es seleccionado entre un visualizador de cristal líquido (LCD), generadores de tonos audibles, lámparas iluminadas, LEDs, una impresora para proporcionar una salida de resultados, materiales fotosensibles, o por lo menos una lámpara para indicar los resultados.

11. Método, según la reivindicación 10, en el que por lo menos dicha lámpara comprende dos o más lámparas.

12. Método, según la reivindicación 5, que comprende además un soporte para sujetar una muestra en posición.

13. Método, según la reivindicación 12, en el que el soporte se selecciona entre una bandeja, una grapa, una ranura, o una combinación de las mismas.

14. Método, según la reivindicación 5, que comprende además medios para dirigir o reforzar la luz, seleccionados entre espejos, lentes, guías de onda, fibras ópticas, o una combinación de estos.

5 15. Método, según la reivindicación 5, que comprende además una máscara específica para la imagen de difracción, y utilizada para bloquear una luz específica.

16. Método, según la reivindicación 15, en el que la máscara está construida y dispuesta para permitir principalmente el paso sólo de luz difractada a su través.

17. Método, según la reivindicación 15, en el que la máscara comprende asimismo medios para 10 hacer girar la máscara.

18. Método, según la reivindicación 15, en el que la rotación de la máscara la dispone de manera que permite que la atraviese principalmente la luz no difractada, y la luz difractada es bloqueada.

19. Método, según la reivindicación 15, en el que la máscara tiene por lo menos dos orientaciones, en el que en una primera orientación, puede pasar a través de la máscara principalmente luz difractada y

15 en una segunda orientación, puede pasar a través de la máscara principalmente luz no difractada, en el que una relación o una diferencia entre las intensidades de la luz difractada y no difractada indica si el analito está presente.

20. Método, según la reivindicación 19, en el que una cantidad de la luz difractada mayor que de la luz no difractada indica la presencia del analito.

21. Método, según la reivindicación 19, en el que una cantidad de la luz no difractada mayor que 20 de la luz difractada indica la presencia del analito.