SISTEMA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO CONSTITUIDO POR UNO O MÁS SENSORES ÓPTICOS Y UNA O MÁS FUENTES DE LUZ, PROCESO ASOCIADO Y APLICACIONES RELACIONADAS.

Sistema para detección, identificación y cuantificación en material biológico,

compuesto por una o más fuentes de luz (1) combinado con uno o más fotosensores ópticos (6 y 7) y diversos componentes electrónicos (4), necesarios para obtener/procesar la señal emitida caracterizado por: a) La fuente de luz (1), pulsada (2) o no, compuesta de láseres de estado sólido de baja energía o diodos emisores de luz, cuyo rango de longitud de onda está localizado entre 400 y 800 nm con una intensidad de luminosidad controlable que varía entre los valores de 0.01 mW/cm 2 y 100 mW/cm 2 ; b) El fotosensor, sencillo (6 y 7a) y (6 y 7b) o integrado (6, 4 y 7) compuesto de películas delgadas de silicio amorfo o nanocristalino o microcristalino y/o por semiconductores de cerámica tales como IGZO, IAgZO, SnZIO, GZIO, CuOIZ, GITO, entre otros, y basado en estructuras tipo pi'ii'n o MIS, que funciona en un rango de longitudes de onda desde el infrarrojo hasta el ultravioleta, y prové una información cualitativa y cuantitativa basada en la hibridización especifica y selectiva de sondas funcionalizadas con nanopartículas de metal; c) Siendo provista la eliminación del sistema a través de una fuente de energía convencional o a través de baterías fotovoltaicas, que dan portabilidad al sistema, siendo focalizada la luz emitida sobre la muestra, preferiblemente utilizando microlentes, siendo la muestra o muestras no fijadas físicamente al sensor o sensores, colocando la muestra biológica referida (5) sobre el lado opuesto (6) del sustrato donde se deposita el fotosensor (6 y 7)

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Campo de la Invención

La presente invención se relaciona con un nuevo sistema y proceso capaz de analizar muestras moleculares orgánicas

o soluciones compuestas bilógicas acuosas con base en métodos colorimétricos (detección, cuantificación eidentificación) utilizando una estructura de silicio amorfo pi'ii'n altamente sensible a la luz visible con una combinación de silicio amorfo y semiconductores activos con base en cerámicas como detectores y nanopartículas metálicas como nanosondas que contienen las especies que se van a analizar, además del uso de una luz monocromática roja o azul suministrada por un diodo o laser que emite luz. El sistema antes descrito es capaz de detectar y cuantificar las diferencias colorimétricas producidas por soluciones que contienen nanosondas, preferiblemente oro.

15 Estas sondas pueden funcionalizarse con oligonucleótidos específicos, complementarios con secuencias de ADN/ARN, proteínas, y por ejemplo anticuerpos y/o antígenos relacionados con ciertas enfermedades, u otras muestras o soluciones de composiciones biológicas, y puede aplicarse en diversas áreas de la biotecnología, incluyendo la biomedicina.

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Resumen de la Invención

La presente invención se relaciona con un sistema y proceso para la detección y/o identificación cualitativa y cuantitativa de una muestra o solución acuosa de composiciones biológicas, como por ejemplo secuencias especificas de ácidos nucleicos presentes en muestras bilógicas, que cuando se funcionalizan con nanosondas metálicas, cambian sus rangos de absorción/emisión de acuerdo con las reacciones químicas.

El proceso de detección y cuantificación se basa en la respuesta de un fotosensor, estructuras pi'ii'n singular o integrada, con base en la tecnología de película delgada de silicio amorfo, nanocristalino o microcristalino y sus aleaciones, así como en los nuevos semiconductores activos cerámicos, tales como óxidos, amorfos o no amorfos capaces de detectar ópticamente la luz absorbida/emitida.

La estructura del fotosensor detecta y cuantifica la variación de color, asociada a una referencia (señal de la fuente de luz). Esta variación de color es causada por nanosondas de metal, siendo este preferiblemente oro, cuando sefuncionalizan con la muestra o la solución acuosa de composiciones biológicas, como por ejemplo oligonucleótidos complementarios a secuencias especificas de ADN/ARN que van a se investigadas.

La respuesta de detección corresponde a la diferencia entre los valores de referencia (haz de luz directamente sobre el sensor) y los valores después de la introducción del liquido biológico.

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Esta señal analógica se condiciona apropiadamente mediante la electrónica apropiada y se presenta en forma analógica

o digital.

La señal resultante, a través de la selección apropiada del algoritmo de calibración de corrección, es proporcional a la 45 concentración de la muestra biológica funcionalizada en las sondas.

El sistema referido y el proceso de detección y/o identificación y proceso de cuantificación resultante del análisis molecular de la muestra o solución acuosa de la composición biológica tiene aplicación en biotecnología, incluyendo biomedicina, como por ejemplo, en la cuantificación y detección de secuencias de ácidos nucleicos presentes en una

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Antecedentes de la Invención

Actualmente, en muchos diagnósticos clínicos y de laboratorio de muestras bilógicas, se requieren sistemas simples de bajo coste, con la posibilidad de cuantificar cantidades muy pequeñas de una forma rápida y confiable.

Entre estos, se pone gran interés en la identificación de ácidos nucleicos, ADN/ARN, y/o proteínas, por ejemplo anticuerpos y/o antígenos relacionados con cierta enfermedad.

Los ácidos nucleicos son el material genético de cualquier organismo viviente, que contienen información especifica que permite su caracterización completa. Por lo tanto, es posible identificar secuencias características para cada ser viviente, a partir de las cuales puede obtenerse información relevante: identificación de secuencias; identificación de mutaciones que pueden causar enfermedades; detección de agentes patogénicos tales como bacterias y virus, etc [1].

La mayor parte de las técnicas de caracterización conocidas para secuencias de ADN/ARN se basan en al hibridización selectiva y especifica de pequeños oligonucleótidos (sondas) con la secuencia complementaria de ADN (objetivo). Actualmente, los métodos de fluorescencia o radioactividad son los más utilizados para la detección de secuencias especificas por hibridización. Sin embargo, se verifica que estas técnicas son costosas y extremadamente lentas [2, 3]. Además, las técnicas de hibridización necesitan una cantidad significativa de objetivo para obtener una señal. Siguiendo este procedimiento estas técnicas son susceptibles principalmente de aplicarse después de un proceso de amplificación del ácido nucleico a partir de la muestra en cuestión, a través de la técnica de reacción en cadena de polimerasa-PCR. El PCR permite la amplificación de numero de moléculas de ADN disponible, imitando lo que sucede en el proceso de multiplicación de las células en un organismo.

Las nuevas técnicas de amplificación en tiempo real (por ejemplo PCR en tiempo real) ofrecen un alto nivel de automatización y disminuyen el tiempo necesario para la amplificación y detección. Con el uso de estas técnicas, también es posible obtener resultados cuantitativos.

No obstante, a pesar de los altos costes asociados con los equipos y para las pruebas, estas tecnologías presentan una gran desventaja, la cual evita un uso más amplio en los laboratorios, el manejo de muestras, puesto que se requieren muestras altamente purificadas lo cual requiere personal y laboratorios equipados altamente especializados [4] [5].

Más recientemente, los chips de ADN (microgrupos de sensores integrados) han ganado alguna popularidad. Su principal aplicación ha estado en los estudios de expresión genética, donde los chips ofrecen análisis simultáneos de diversos genes para una muestra simple. Básicamente, esta técnica se basa en la hibridización simultanea y un alto numero de muestras con cantidades mínimas de muestra.

Ha pesar de todo esto, la etapa de amplificación es aun requerida. Adicionalmente, el contenido del chip es todavía un problema que debe resolverse, además de que es una tecnología costosa, puesto que estos chips no son reutilizables [6].

Se han desarrollado varios métodos colorimétricos para la detección de ácidos nucleicos [7-10]. Algunos de estos métodos se basan en las propiedades ópticas (resonancia de plasmón en superficie) de oro u otras nanopartículas metálicas [11-12], en función de su forma y tamaño.

Estas nanopartículas de oro u otro metal, tal como plata o aleaciones plata-oro son extremadamente sensibles a los cambios en el medio, presentando una variación de color, de rojo a azul en el caso del oro. La variación de color puede ser el resultado de la agregación de varias partículas, por ejemplo, mediante la acción de una cadena de ADN no complementaria.

El cambio de color es una respuesta macroscópica originada a partir de un fenómeno de escala nanométrica, cuando el ADN/ ARN puede comportarse en una forma complementaria o no complementaria. Para cada una de estas reacciones existe una respuesta de sistema de sensor diferente para la absorción de la luz incidente.

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Haciéndolo así, la hibridización de sondas de ADN o ARN enlazadas a partículas de oro para la identificación de secuencias especificas es una técnica de bajo coste y fácil de utilizar, que podría ser una alternativa para los métodos convencionales. No obstante, aunque la técnica basada en nanopartículas de oro es bastante sensible y de bajo coste, aun requiere la necesidad de registrar... [Seguir leyendo]

1. Sistema para detección, identificación y cuantificación en material biológico, compuesto por una o más fuentes de luz (1) combinado con uno o más fotosensores ópticos (6 y 7) y diversos componentes electrónicos (4), necesarios para obtener/procesar la señal emitida caracterizado por:

a) La fuente de luz (1), pulsada (2) o no, compuesta de láseres de estado sólido de baja energía o diodos emisores de luz, cuyo rango de longitud de onda está localizado entre 400 y 800 nm con una intensidad de 10 luminosidad controlable que varía entre los valores de 0.01 mW/cm2 y 100 mW/cm2;

b) El fotosensor, sencillo (6 y 7a) y (6 y 7b) o integrado (6, 4 y 7) compuesto de películas delgadas de silicio amorfo o nanocristalino o microcristalino y/o por semiconductores de cerámica tales como IGZO, IAgZO, SnZIO, GZIO, CuOIZ, GITO, entre otros, y basado en estructuras tipo pi'ii'n o MIS, que funciona en un rango de longitudes de onda desde el infrarrojo hasta el ultravioleta, y prové una información cualitativa y cuantitativa basada en la hibridización especifica y selectiva de sondas funcionalizadas con nanopartículas de metal;

c) Siendo provista la eliminación del sistema a través de una fuente de energía convencional o a través de baterías fotovoltaicas, que dan portabilidad al sistema, siendo focalizada la luz emitida sobre la muestra, preferiblemente utilizando microlentes, siendo la muestra o muestras no fijadas físicamente al sensor o sensores, colocando la muestra biológica referida (5) sobre el lado opuesto (6) del sustrato donde se deposita el fotosensor (6 y 7).

2. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) es sensible al color y a la intensidad de la luz; porque tiene una responsividad entre 10 y 108 para el rango de longitud de onda que se va a usar; por que tiene una relación señal a ruido por encima de 3 dB; por que tiene tiempos de respuesta superiores a 50 s; por que tiene corrientes de saturación de menos de 10-7 A/cm2; y para lleva acabo el pico de absorción y el control responsividad respectiva a través del contenido de hidrogeno o de la aleación de la capa o capas fotosensibles que constituyen el sistema y/o por polarización adecuada del sensor.

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3. Sistema para detección, identificación y cuantificación de material biológico de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) es capaz de producir una variación monotónica de la señal eléctrica (corriente o voltaje), que es proporcional a la concentración de la muestra bilógica (5), cuando se seleccionan la calibración correcta y el algoritmo de corrección.

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4. Sistema la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) es capaz de proporcionar la energía necesaria para su autopolarización.

40  5. Sistema para detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) es producido sobre cualquier tipo de sustrato (6), tal como celulósico, polimérico, vítreo, cerámico y metálico, siendo este transparente al rango de longitud de onda de interés y micromaquinado o no, sobre el lado opuesto donde se deposita el fotosensor.

45  6. Sistema para detección, identificación y cuantificación de material biológico de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que los fotosensores integrados (6, 4 y 7) (6 y 7) son capaces de ser dispuestos en forma lineal, como disposiciones lineales de sensores, en forma de matriz o una configuración en tándem (dispositivos apilados).

50  7. Sistema para detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que el cualquiera de las estructuras previamente citadas es capaz de ser empacada por laminación o no.

8. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con la Reivindicación previa 5, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) esta basado en estructuras tipo pi'ii'n (6 y 7a) que incluyen contactos de carga inyector/ detector (9, 13); capa intrínseca basada en una aleación (10, 12); capa fotosensible de respuesta espectral ajustable (11), de acuerdo con su composición.

9. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones previas, caracterizado por que el fotosensor (6 y 7) esta basado en estructuras MIS (6 y 7b), que incluyen un contacto tipo metálico (16), una nanocapa compuesta de un elemento dieléctrico, con altas propiedades de aislamiento (17) y una capa fotosensible de pico de absorción ajustable (18), de acuerdo con

5 su composición.

10. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado por que la fuente de luz (1) es un conjunto de estado solido, de espectro de radiación bien definido y extremadamente estrecho, que cubre eventualmente todo el espectro de la región visible.

11. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la fuente de luz (1) es monocromática, controlable y con potencias de salida de 100 a 0.01 mW/cm2.

12. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones precedentes, caracterizado por una fuente de luz (1), un fotosensor (6 y7) conectados a una fuente de voltaje controlada (19) y mediante un microcontrolador (24), un filtro (20), un circuito amplificador (21), un circuito comparador (22), un generador de señal de referencia (23), conectado a un microcontrolador y

20 a un micropocesador fijo o portátil.

13. Sistema para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones previas , caracterizado por: a) El fotosensor (6 y 7) conectado a la fuente de voltaje (19), con el fin de proceder a su polarización; b) La fuente de voltaje (19) controlada por un microcontrolador (24); c) Un filtro (20) que existe a la salida del sensor (6, 7); d) El filtro (20) conectado a un circuito amplificador (21); e) El circuito amplificador (21) conectado al circuito comparador (22) el cual genera un señal de referencia

35 (23)-respuesta cualitativa, siendo esta señal controlada también por un microcontrolador (24); f) Todos los elementos previos conectados a un microprocesador, para almacenamiento de datos, procesamiento de datos y conversión A/D.

14. Proceso para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, caracterizado por el uso del

40  sistema descrito en las Reivindicaciones anteriores y sondas de nanopartículas metálicas, preferiblemente oro, con la integración de sensores sencillos (6 y 7) o tándem/multicapa (6 y 7a), (6 y 7b) con base en la tecnología de película delgada de silicio y sus aleaciones, con fuentes de luz monocromáticas y controlables (1), de nuevo de acuerdo con las Reivindicaciones previas.

45 15. Proceso para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con la Reivindicación 14, caracterizado por:

a) Preparar soluciones de sonda de nanopartículas metálicas, preferiblemente oro, de diámetro entre 5 y 30 nanómetros; 50 b) Mezclar la muestra de ácidos nucleicos que va a ser detectada y/o identificada con la sonda en un intervalo de temperaturas entre 5 y 45 ºC; c) Promover el enlazamiento/agregación de sondas de nanopartículas metálicas a la muestra debido a una variación de la fuerza iónica en el medio de solución;

d) Colocar las fuentes resultantes, o liquido biológico (5) sobre la superficie posterior del fotosensor (6) del sistema de detección definido en la Reivindicaciones 1 a 14, sin tener un contacto directo entre las sondas de nanopartículas de oro y el sensor (6), para poshibridización.

16. Uso del sistema de proceso para detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo con las Reivindicaciones precedentes, caracterizado por que es aplicable a la detección e identificación cualitativa y cuantitativa de material genético presente en una muestra biológica.

17. Uso del sistema de proceso para la detección, identificación y cuantificación de material biológico, de acuerdo

con las Reivindicaciones previas, por que se basa en un método colorimétrico, cuyo cambio de color se detecta 10 mediante un sensor de fibra óptica, de acuerdo con:

a) La longitud de onda de la luz emitida/absorbida por el medio; b) El desplazamiento de longitud de onda, como función de la señal de referencia; c) Intensidad de la señal emitida/absorbida, como función del número de fentomoles capaces de ser

15 detectadas;

d) Cambio en la intensidad de la señal eléctrica capaz de ser detectado (corriente o voltaje) por más de un sensor, dispuesto en una configuración tándem/multicapa donde el pico de absorción asociado con cada estructura apilada puede desplazarse;

e) Respuesta a frecuencia, como función de la polarización aplicada al sensor; 20 f) Respuesta de pico de intensidad controlable, como una función del voltaje de polarización aplicado.

18. Uso de un sistema fijo o portátil y proceso para la detección, identificación y cuantificación de material bilógico, de acuerdo con las Reivindicaciones precedentes, caracterizado por la configuración de los sistemas detección y/o de identificación y/o cuantificación de sistemas de muestras de soluciones de compuesto biológicos, tal como ácidos nucleicos, oligonucleótidos complementarios a secuencias específicas de ADN/ARN, proteínas, tales como anticuerpos y/o antígenos relacionados con ciertas enfermedades, presentes en una muestra biológica.