PROCESO PARA DETERMINAR LOS PARAMETROS DE ENLACE DE REACCIONES DE ENLACE DE BIOAFINIDAD.

Procedimiento para determinar parámetros de enlace, incluyendo constantes de disociación y constantes de velocidad de sorción,

del enlace entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma, estando ambas presentes en una fase líquida, y comprendiendo una etapa de enlazamiento sin marcador, caracterizado por las siguientes etapas:

(a) fijar

(a1) la pareja de enlace, o

(a2) la biomolécula, a una superficie sólida;

(b) permitir el enlazamiento entre la pareja de enlace y la biomolécula, tanto en la fase líquida como sobre la superficie sólida;

(c) fijar un marcador a:

(c1) la biomolécula, si dicha pareja de enlace se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a1), o a

(c2) la pareja de enlace, si dicha biomolécula se ha fijado a la superficie sólida de acuerdo con la etapa (a2);

(d) permitir que el marcador dé lugar a un precipitado;

(e) detectar dicho precipitado a medida que se forma sobre dicha superficie sólida, determinando un cambio de la masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho precipitado;

(f) determinar las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula en la fase líquida comparando la velocidad de formación del precipitado con una curva estándar, y

(g) calcular las constantes de enlace a partir de las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula determinadas de este modo

Proceso para determinar los parámetros de enlace de reacciones de enlace de bioafinidad.

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar parámetros de enlace, incluyendo constantes de disociación y constantes de velocidad de sorción, del enlace entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma, estando ambas presentes en una fase líquida, y comprendiendo una etapa de enlazamiento sin marcador.

Los procedimientos para determinar los parámetros de enlace del enlazamiento libre de marcador entre biomoléculas y sus parejas de enlace son generalmente conocidos en la técnica. Haake, H.M., Schütz, A. en Gauglitz, G., Fresenius, J. Anal. Chem. (2000) 366: 576-585, proporcionan una notable revisión de los mismos.

Tal como es generalmente conocido en el estado de la técnica, la constante de disociación (abreviada como K_d) de un enlace particular se define como la relación entre la llamada "constante de velocidad de activación de sorción" (abreviada como k_on) y la "constante de velocidad de desactivación de sorción" o constante de velocidad de desorción (abreviada como k_off), y se puede expresar mediante la ecuación K_d = k_off/k_on.

En el contexto de la presente invención, el término "biomolécula" se define como una molécula de origen biológico, tales como, aunque sin limitarse a las mismas, una proteína, ácido nucleico, lípido, hidrato de carbono, esteroide y prostaglandina, la cual se forma in vivo o in vitro, y que, en el último caso, es idéntica o equivalente a la forma natural de dicha biomolécula, presentando la misma habitualmente, aunque no necesariamente, una actividad biológica o fisiológica.

En el contexto de la presente invención, el término "pareja de enlace" se define como una molécula que presenta una afinidad, y hasta cierto grado también especificidad, por una biomolécula particular. Habitualmente, aunque no necesariamente, la pareja de enlace es un compuesto orgánico de bajo peso molecular (por ejemplo, un esteroide, siendo la biomolécula una proteína receptora de superficie celular; o una molécula de substrato orgánico, siendo la biomolécula una enzima); sin embargo, la propia pareja puede ser también una biomolécula (por ejemplo, un anticuerpo, que esencialmente es una proteína, siendo la biomolécula un antígeno que, a su vez, puede ser una proteína).

Esencialmente, los métodos según la técnica anterior (FÄGERSTAM y otros (1992), J. Chromatog., 597, 397-410; WO-A- 03/056296) miden el enlazamiento de una biomolécula (tal como un anticuerpo) sobre superficies sólidas recubiertas con una pareja de enlace para una biomolécula (tal como un antígeno) en soluciones tampón. Habitualmente, la superficie se recubre, por ejemplo, con la biomolécula, ya sea por acoplamiento covalente o por adsorción física. A continuación, el valor de K_d se estima para una serie de concentraciones crecientes de la pareja de enlace, esencialmente como la concentración para la cual el enlace es la mitad del máximo. Alternativamente, el valor para la constante de velocidad de adsorción (k_on) se estima a partir de la fase inicial de adsorción, y el valor para la constante de velocidad de desorción (k_off) se estima a continuación eliminando la pareja de enlace (por ejemplo, mediante lavado o enjuagado) y midiendo de algún modo la desorción.

Sin embargo, los procedimientos según la técnica anterior para determinar los parámetros de enlace presentan diversas desventajas, particularmente en el caso en que los valores de K_d son menores de 10^-9 M. En primer lugar, incluso para la adsorción limitada por el transporte de la pareja de enlace (que generalmente no se alcanza), la adsorción de la pareja de enlace conlleva en la práctica demasiado tiempo cuando las concentraciones de dicha pareja de enlace están dentro del intervalo 10^-10 M - 10^-11 M. En segundo lugar, debido a los elevados valores de k_on involucrados, la adsorción renovada de la pareja de enlace durante el enjuagado o lavado (que se requiere para cada concentración de biomolécula o pareja de enlace) resulta significativa, y la llamada "k_off aparente" (abreviada como k_off,app) se vuelve mucho menor que el valor de la k_off real. Además, las interacciones débiles y no específicas de las moléculas de pareja de enlace adsorbidas con la superficie pueden interferir negativamente en la desorción, incluso hasta el punto de que el enlace se vuelve prácticamente irreversible.

Existe la necesidad de un procedimiento que esté menos sujeto, o preferentemente no lo esté en absoluto, a las limitaciones mencionadas anteriormente con respecto a las mediciones cuando las constantes de disociación son menores de 10^-9 M. Además, existe una necesidad de un procedimiento para determinar los parámetros de enlace del enlazamiento entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma que comprenda menos etapas y, en consecuencia, resulte menos laborioso y fatigoso que el método según la técnica anterior.

El procedimiento para determinar parámetros de enlace según la presente invención es un procedimiento tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 15 y se caracteriza por las siguientes etapas:

La superficie sólida se utiliza como herramienta de medición cuando se mide el equilibrio de enlace en la fase líquida. La pareja de enlace o la biomolécula se fijan a una superficie sólida pretratada (etapa a). La cantidad de enlazamiento a la superficie por parte de la pareja de enlace (o, respectivamente, la biomolécula) es una medida de la concentración libre de la pareja de enlace (o, respectivamente, la biomolécula) en la fase líquida (etapa b). La amplificación de la señal resulta necesaria para medir las concentraciones, a menudo muy bajas, y la misma se alcanza fijando un marcador a la biomolécula (o, respectivamente, a la pareja de enlace) (etapa c). El enlace en sí está libre de marcador (evitándose de este modo los cambios inducidos por el marcador en las afinidades de enlazamiento y un posible error en la estimación de la constante de disociación). A continuación, se deja que el marcador dé lugar a un precipitado (etapa d) y la velocidad de formación de dicho precipitado sobre la superficie sólida se detecta determinando un cambio de masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho precipitado.

Una ventaja del presente procedimiento consiste en que, dado que el precipitado se detecta determinando un cambio de la masa superficial en la superficie sólida, únicamente el substrato convertido directamente en la superficie contribuye a la formación de precipitado. Los pequeños agregados de substrato convertido en la fase líquida no interfieren en la medición. Este hecho conduce a un así denominado procedimiento de ensayo en una etapa para determinar los parámetros de enlace, desprovisto de las laboriosas y fatigosas etapas de lavado o enjuagado, obligatorias cuando se utilizan los procedimientos según la técnica anterior. Según la presente invención, el equilibrio se obtiene de forma bastante rápida. La concentración de pareja de enlace libre (o biomolécula libre) se puede determinar comparando la velocidad de formación del precipitado con una curva estándar. A partir de las concentraciones libres medidas de este modo, se calculan las constantes de enlace. Una importante ventaja del procedimiento según la presente invención consiste en que las concentraciones libres se pueden medir mientras están en equilibrio con complejos de la biomolécula y la pareja de enlace de la misma. De este modo, las interacciones no específicas mencionadas...

1. Procedimiento para determinar parámetros de enlace, incluyendo constantes de disociación y constantes de velocidad de sorción, del enlace entre una biomolécula y una pareja de enlace de la misma, estando ambas presentes en una fase líquida, y comprendiendo una etapa de enlazamiento sin marcador, caracterizado por las siguientes etapas:

(a) fijar

(b) permitir el enlazamiento entre la pareja de enlace y la biomolécula, tanto en la fase líquida como sobre la superficie sólida;

(c) fijar un marcador a:

(d) permitir que el marcador dé lugar a un precipitado;

(e) detectar dicho precipitado a medida que se forma sobre dicha superficie sólida, determinando un cambio de la masa superficial en la superficie sólida debido a la formación de dicho precipitado;

(f) determinar las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula en la fase líquida comparando la velocidad de formación del precipitado con una curva estándar, y

(g) calcular las constantes de enlace a partir de las concentraciones libres de la pareja de enlace o la biomolécula determinadas de este modo.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula es una enzima y la pareja de enlace es un inhibidor o un substrato de la misma.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula es una proteína de membrana celular y la pareja de enlace es un ligando de la misma.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína de membrana celular es un receptor.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula es una proteína de membrana celular y la pareja de enlace es una estructura de membrana celular.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque la estructura de membrana celular es artificial.

7. Procedimiento, según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque la estructura de membrana celular es una célula completa.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la biomolécula es un anticuerpo o un fragmento del mismo, y la pareja de enlace es un antígeno de dicho anticuerpo o fragmento.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el marcador es una enzima que produce un precipitado a partir de un substrato soluble.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la superficie sólida es una placa de silicio.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la superficie sólida es un vidrio recubierto de cromo por pulverización catódica.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la determinación del cambio de masa de la superficie en la etapa (e) se lleva a cabo por elipsometría.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la etapa de determinación de un cambio de masa de la superficie se lleva a cabo sobre un área de superficie menor de 3,0 mm².

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la constante de disociación es menor de 10^-9 M.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, caracterizado porque la constante de disociación está dentro del intervalo 10^-9 M - 10^-13 M.